Chromatographie d'exclusion sur gel + spectrophotométrie différentielle

[invite13e4bad5]

Bonsoir à toutes et à tous!!
En ce moment je suis confronté à l'explication de mon TP (que j'ai mardi). La manipulation consiste à réaliser une chromatographie d'exclusion pour déterminer le poids moléculaire du cytochrome c. Pour l'instant j'ai compris le principe de cette technique, les molécules les plus grosses (bleu dextran) ne passent pas dans les billes poreuses du gel et sont éluées rapidement donc : Ve dextran = V0 (volume d'exclusion ou mort). Les molécules, dont la taille permet de traverser les billes (fluorescéine : jaune), vont être fortement retardées soit : Ve fluoro. = Vt (volume total). Puis on récupère entre les deux les molécules de cytochrome c (rouge). On a donc x tubes à essai et chaque couleur (bleu, rouge et jaune) sont représentées par trois tubes à essai. Les autres tubes sont incolores. On mesure l'absorbance des 9 tubes (3 rouges, 3 bleus...). On trace l'absorbance en fonction du volume élué sur un graphique. Dès qu'on a les Ve de chaque espèce, on calcule le volume élué relatif pour chacune d'entre elles.

Questions :
1) Comment peut-on trouver les volumes élués à partir de l'absorbance?
2) Quel est le rôle du volume élué relatif?
3) Comment déterminer le poids moléculaire à partir du volume élué?


La manipulation suivante consiste à prendre l'un des tubes du cytochrome c et de réaliser sa spectrophotométrie différentielle. Il faut mesurer l'absorbance du cytochrome c oxydé et réduit.

Questions :
1) Je ne comprends pas pourquoi on fait cette manipulation dans le sens où >> A-t-elle une correspondance avec la manipulation précédente?
2) Comment et pourquoi (lien avec la question précédente) calculer le spectre différentiel réduit-oxydé?

Merci d'avance pour vos éventuelles réponses, bonne soirée.
-----

[invite935d76c1]

bonjour!

1 ere partie:
1) dans le doute, je prefere ne pas dire de bêtises
2)une fois trouvé le volume d'élution des différents composés, tu peux faire un rapport des volumes du genre (Vx-V0)/(Vt-V0) (x pour le Cyt C) ( la formule exacte doit etre dans ton cours) ce qui permet de determiner un nombre qui normalement le même pour n'importequelle colone de même propriétés (ex colonne 2x plus longue, le rapport sera toujours le même) en faisant une analogie ca peut "ressembler " à un rapport frontal que tu pourrait retrouver pour une chromato sur couche mince.
3) je ne me rapelle plus; de mémoire il s'agit d'une échelle logarithmique

2eme partie :
1) l'oxydation de ta protéine (le cytochrome c est une proteine) pourrait changer sa confoemation et donc changer son taille/forme apparente et donc son poids apparent.
2) du fait de l'oxydation, le spectre d'absorbtion peut être different. comment faire? faire la mesure sur le tube "natif" puis l'oxyder (eau oxygénée par exemple) puis refaire la mesure. tu peux aussi faire un scan pour les deux formes pour voir s'il existe un changement de la longueur d'onde d'absorbance maximale.

en espérant que cela puisse aider

[invite13e4bad5]

Bonjour, merci pour votre réponse qui m'a bien aidé. La partie 1 je l'ai bien assimilée en fouinant à droite à gauche. Par contre pour la partie 2 il n'y avait rien du tout sur le net. Merci de votre précision sur le sujet =). Bonne journée

[invite13e4bad5]

Bonsoir, j'ai les mesures permettant de faire les calculs. En ce qui concerne la première manip je ne pense pas qu'il y ai des problèmes (surement des imprécisions au niveau des mesure de l'absorbance). Par contre nous avons récupéré la feuille de synthèse et le graphique annexe du spectre du cytochrome et apparemment comme vous me l'avez dit il suffit de différencier les pics d'absorption maximum mais je ne sais pas trop comment interpréter tout ça.
Merci d'avance =). Bonne soirée

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite935d76c1]

Bonsoir,

je ne vais pas donner de réponse, en plus je ne la connais pas,

par contre je me tournerai bien vers le coté fonction et fonctionnement "naturel" du cytochrome C...

indice: il peut avoir une forme réduite et une forme oxydée
indice: il ne se trouve pas n'importe où ...

bonne réflexion!

[invite13e4bad5]

Bonjour, si je me souviens bien on le retrouve au niveau d'un complexe (le IV je crois) de la chaîne respiratoire mitochondriale. Mais j'imagine bien que la plupart du temps on le retrouve sous sa forme oxydée ou réduite et non sous sa forme neutre.