Purification de protéine pour ELISA

[Anetheron]

Bonjour,

J'aimerais avoir quelques critiques de biochimistes sur une idée de protocole pour la purification préliminaire d'une petite protéine en vue d'un dosage ELISA.

Mon principal problème (outre mes connaissances très limitées en biochimie) est que mon laboratoire dispose de relativement peu de moyens, et que je ne peux donc pas faire des anticorps adaptés "à la carte". Je ne dispose que d'un seul anticorps (polyclonal) capable de se liguer à elle (A), et d'un seul anticorps conjugué (B, polyclonal aussi) qui reconnaît l'anticorps A.

Ma première idée était de faire un ELISA en sandwich avec :
- au fond de la plaque l'anticorps A
- ma protéine (dans une matrice biologique assez complexe)
- encore l'anticorps A
- enfin l'anticorps B conjugué à une peroxydase pour faire le dosage.

Mais comme l'anticorps A est utilisé 2 fois, j'ai peur que le conjugué ne se fixe aussi aux Ac A coatés à ma plaque mais sur lesquels ma protéine ne s'est pas fixée, et que du coup j'aie à peu près le même signal partout.

J'ai donc pensé utiliser une méthode ELISA directe, en coatant ma protéine sur le fond de la plaque, puis anticorps A, puis B.
Mais, là encore, j'ai des doutes, notamment à cause de la complexité de mon milieu biologique (de l'hémolymphe). J'ai peur que ma protéine soit tellement "noyée" au milieu de toutes les autres que je ne puisse rien voir à la révélation...

Qu'en pensez-vous? Mes craintes sont elles justifiées?
Si c'est le cas, je pensais alors faire une purification préalable de ma protéine par chromatographie, sachant que j'ai pas mal d'infos dessus, notamment sa taille exacte (~15 kDA) et son pI (~9). Je pourrais par exemple enchaîner :
- une chromato d'exclusion en récupérant uniquement les protéines < 20 kDa
- une chromato d'échange ionique pour la sélectionner sur la base de son pI
- éventuellement une chromatographie avec les anticorps A fixés sur des microbilles pour la retenir de façon spécifique (je ne connais pas le nom exact...).

Encore une fois que pensez-vous de cet enchaînement? Est-ce suffisant? La chromatographie avec les anticorps est-elle indispensable?
Et dans l'autre sens : un tel enchaînement ne risque-t-il pas d'être difficile à reproduire? Ne va-t-il pas me faire perdre trop de protéine pour faire un bon dosage?

J'espère avoir été assez clair dans mes explications, et surtout que quelqu'un pourra m'aider un peu... Toute critique est bienvenue!
Bonne soirée,
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[Zellus]

Bonsoir,

Qu'en pensez-vous? Mes craintes sont elles justifiées?

Oui, et c'est bien les craintes de toute personne qui souhaite développer un ELISA.
On ne peut jamais savoir comment vont se comporter nos protéines avant d'avoir tester empiriquement. Et c'est d'autant plus difficile à prévoir si ta protéine se trouve au beau milieu d'un lysat cellulaire.
Et c'est pour ça que tu es obligé de purifier ta protéine au moins une fois avant pour te faire une gamme étalon.
Après, je te conseille plutôt de faire un ELISA sandwich lorsque tu veux doser un antigène dans un mélange.

Qu'en pensez-vous? Mes craintes sont elles justifiées?
Si c'est le cas, je pensais alors faire une purification préalable de ma protéine par chromatographie, sachant que j'ai pas mal d'infos dessus, notamment sa taille exacte (~15 kDA) et son pI (~9). Je pourrais par exemple enchaîner :
- une chromato d'exclusion en récupérant uniquement les protéines < 20 kDa
- une chromato d'échange ionique pour la sélectionner sur la base de son pI
- éventuellement une chromatographie avec les anticorps A fixés sur des microbilles pour la retenir de façon spécifique (je ne connais pas le nom exact...).

Attention, la chromatographie d'exclusion n'est pas faite pour purifier une protéine à partir d'un lysat !
Tu ne peux déposer que de très petits volumes sur ce type de colonne, et tu ne pourrais pas bien séparer ta protéine de toutes les autres de toute façon dans cette bouillie infâme.
Tu devrais commencer par une échangeuse d'ions puis continuer avec une chromatographie hydrophobe par exemple.
C'est à toi de tester après, une fois de plus tout est empirique.
Si tu avais une résine avec tes anticorps fixés ce pourrait être bien oui. Mais ce n'est pas forcément indispensable.
Après, si tu as commencé à bien purifier ta protéine mais qu'il te reste des contaminants, tu peux la séparer des autres par ultrafiltration.
Et tu pourrais même tester une précipitation différentielle avec du sulfate d'ammonium si tu veux, avant ou après la chromato. Bref, il y a plusieurs moyens de se débarrasser des autres protéines.

Et dans l'autre sens : un tel enchaînement ne risque-t-il pas d'être difficile à reproduire? Ne va-t-il pas me faire perdre trop de protéine pour faire un bon dosage?

Tout dépend de la quantité de matériel dont tu disposes.
Et tu ne peux pas la produire de manière recombinante ?