Denaturation des IgG avant western-blot

[Enialix]

Bonjour,

Quelqu'un connaitrait-il la temperature minimum necessaire pour denaturer les IgG avant un western-blot?
Je dois étudier une protéine produite par une souris, mais le seul anticorps disponible a été fait chez la souris , l'autre problème est que ma protéine fait environ 150 kd, et que je vois une jolie bande d'IgG a cette taille.
Vous me direz : mais pourquoi ne pas dénaturer a 90 degrés comme tout le monde?
Et bien par ce que ma protéine fait des aggregats si je chauffe, d'ou ma question de température minimum, en espérant que les IgG soient dénaturés, mais que ma prot ne soit pas aggregée.

Merci d'avance,
Enialix
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[Enialix]

Coucou,

Personne n'aurait une petite idée?

[Flyingbike]

pourquoi ne pas utiliser une solution de masquage des IgG ?

[Enialix]

Bonjour, et merci beaucoup de ta réponse.

Je ne savais pas qu'une telle solution existait. En as tu une a recommander?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Aqualung]

Es-tu obligé de dénaturer à la chaleur? Du SDS ou de l'urée 8M ne seraient-ils pas suffisants? Les anticorps étant multimériques et attachés par des ponts disulfures, n'utilise pas d'agents réducteur sinon tu obtiendra plusieurs bandes bien différentes

[Enialix]

Bonjour Aqualung, merci de ta réponse.

Mon tampon (Laemmli) contient déjà du SDS (pas suffisant pour dénaturer les anticorps), mais je n'ai pas tenté l’urée.
Comment fait tu en pratique pour l’urée? Tu pèses ce qu'il faut pour 1 échantillon (typiquement j'utilise 40-50 ul pour un western), ou bien tu fait une solution très concentrée (genre 20M) que tu ajoute a ton échantillon?

Je cherche justement a casser les anticorps. Ma prot fait 150 KDa, et je vois une belle bande d'anticorps a la même taille.

Je me demande si ça pourrait marcher en ajoutant un peu de b-mercapto. Une idée sur la concentration a utiliser?

Merci.