Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

[invite0d3258c2]

Bonjour à tous,
Je cherche le moyen d'optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire. Je travaille sur FAS (274kDa) et je n'arrive pas à la transférer :
Migration sur polyacrylamide 8% avec stacking (5%).
- Tampon de transfert classique (Tris, Glycine, sans SDS)
- Ethanol 20% final


J'ai essayé le semi dry transfer 1h, 25 V et aussi le transfert liquide 35V overnight à 4°C. Mais dans tous les cas, je n'arrive pas à avoir des protéines de plus de 180 kDa.

Que faut-il faire pour sortir cette protéine ? Auriez-vous des pistes à me donner?
Merci.
Diane
-----

[invitef0362c6c]

Salut, j'arrive a sortir un protéine de 289 kDa en utilisant ceci : 4-12% Bis-Tris, running buff 10X SDS, transfert buff EtOH 20%, 2h à 50V.

Bonne chance!

[invite0d3258c2]

Bonjour
Merci pour ta réponse. Peux-tu être plus explicite.
Quel pourcentage de gel fais-tu :
- Pour le running
- Pour le stacking
Quelle est la composition exacte de ton
- Running buffer
- Transfer buffer
J’attends impatiemment vos réponses car je dois relancer un gel.
Merci.

[invitef0362c6c]

Bonjour, pour ma part, j'utilise des gels commerciaux (NuPAGE Novex) qui vont avec l'appareil de Novex. Running très standard : 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS. Transfert : 160 mM Caps, 100 mM NaOH, 20% EtOH. En espérant que ça puisse t'aider!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0d3258c2]

Bonjour
Je relance la discussion, car après avoir tenté maintes fois (en suivant le protocol de Haleckx), je n'arrive toujours pas à sortir ma protéine. Je suis désespérée, au secours! Je fais mes gels moi même. J'ai essayé du 8%, du 6% sans succès. Après coloration au rouge ponceau, la plus grosse protéine que j'ai est de 180 kDa. Avez-vous d'autres pistes??? Sinon, je vais demander à ma chef si on peux acheter les gels commerciaux (NuPAGE Novex). Mais on n'a pas l'appareil. Combien ça coûte d'installer cet appareillage???
Quelqu'un a-t-il d'autres pistes? Merci d'avance pour votre aide!

[TanguyE]

Bonjour,

Le seul truc que t'apportera des gels commerciaux, c'est une meilleure qualité de gel (plus uniforme, plus reproductibles...), si c'est ton transfert qui ne va pas je ne suis pas convaincu que changer pour des gels commerciaux va résoudre le problème.

[inviteae6c05c4]

Bonjour,

Avant de s'attaquer au transfert, êtes-vous sûr, dans un premier temps, que les protéines de cette taille rentrent dans le gel dans vos conditions de migration ?

[invite0d3258c2]

Bonjour et merci pour vos reponses. Je fais une migration a 100V pendant 1h20. Que faut-il changer? Avez-vous des suggestions a me faire?
Merci

[inviteae6c05c4]

Le mieux ce serait de faire migrer la protéine recombinante, si vous l'avez. Ou alors, une protéine de poids moléculaire avoisinant. Pour les gels commerciaux, le gradient 4-20% peut éventuellement être une solution. Vous pouvez demander des échantillons gratuits à un fournisseur bien connu, et faire migrer dans votre appareillage sans avoir à investir en plus dans un autre système. N'oubliez pas non plus les étapes de dénaturation pour une protéine de cette taille : bêta mercapto + chauffage et SDS dans le bleu de charge ET le tampon.

[invitec0b62935]

La première chose à faire, c'est de savoir si le problème est lié à ta protéine ou au transfert. Il y a des marqueurs de poids moléculaires commerciaux qui vont au moins jusqu'à 250 kDa, il faut donc savoir si dans les conditions de ton gel les bandes du marqueur sont transférées ou non. Si tu vois le marqueur de 250, c'est que ta protéine est absente ou partiellement dégradée et c'est là-dessus qu'il faut travailler. Sinon, c'est réellement le transfert.

Personnellement, j'ai transféré efficacement une protéine de 350 kDa mais ça marche uniquement avec les systèmes de transfert à sec. La bande de marqueur à 250 kDa était elle seulement partiellement transférée dans les systèmes liquides et totalement dans les systèmes à sec.
J'ai travaillé avec un gel de 10%.

[invite0d3258c2]

Merci pour vos reponses.
J'utilise un marqueur de 300 kDa et j'arrive a voir le marqueur de 250 kDa. Par contre je fais des gels de 8%
Je vais essayer de faire des gels de 10%. Svenn, peux tu STP, me donner les conditions detaillées?
- Pour le running gel (composition exacte)
- Pour le stacking gel (composition exacte)
Quelle est la composition exacte de ton
- Running buffer
- Transfer buffer
Quels sont les temps et le voltage
-de mgration
-de transfert

Merci de ton aide

Diane

[invitec0b62935]

J'utilise une composition de gel tout ce qu'il y a de plus classique (10% acrylamide, 375 mM Tris 8.8, 0,1% SDS, 0,05% APS, Temed) pour le gel de séparation et (4% acrylamide, 125 mM Tris 6.8, 0,1% SDS, APS, Temed) pour le gel de concentration. Mon running buffer est un tris-glycine-sds mais je ne me rappelle pas de tête les concentrations. Il n'y a pas de tampon de transfert étant donné que c'est un transfert à sec. Une fois que ton gel a migré, tu utilises un appareil spécial pour cela et en quelques minutes, c'est transféré. Ca revient un peu plus cher que la méthode classique (7 à 8 euros par transfert de mémoire) mais pour les grosses protéines ça marche largement mieux. Sur ces appareils, le voltage et l'ampérage sont réglés automatiquement.

Cependant, si tu arrives à transférer des bandes plus lourdes que ta protéine, ton problème ne vient probablement pas du transfert à moins que taprotéine ait une composition en acides aminés très atypique (c'est rare pour une protéine géante). Il faudrait donc être certain que la protéine que tu cherches est bien présente et que ton anticorps la reconnait efficacement dans les conditions ou tu l'utilises.

Ce que je ferais pour cerner un peu mieux le problème, c'est un dot-blot : tu déposes directement sur une membrane de WB 10 µl de ton échantillon, tu attends deux minutes que ça sèche puis tu traites la membrane comme si c'était un WB en reprenant le protocole à l'étape de saturation de la membrane. Si après révélation tu as une tache là où tu as déposé ton échantillon, le problème est le transfert et dans ce cas il faut sans doute que tu trouves un appareil de transfert à sec vu la taille de ta protéine. Si tu n'as pas de tache, ça veut soit dire que ta protéine n'est pas là soit que ton anticorps ne marche pas dans les conditions où tu l'utilises.

[invite0d3258c2]

Bonjour a tous. Je suis de retour et là, je suis vraiment désespérée (car j’ai tout tenté). J ai fais un dot blot comme tu me l’avais conseillé, et j arrive à détecter ma protéine (le signal est très faible, voir inexistant pour certains échantillons, mais c’est normal. C’est ce qu’on veut d’ailleurs montrer en traitant les cellules différemment). J’ai alors acheté des gels commerciaux de chez BioRad ( 10%). J’ai suivi leur protocole de migration (200V pendant 45 min), j’ai fais le semi dry transfert à 25V pendant 2h. Le transfert a été parfait car mon marqueur de poids moléculaire de 300kda a été bien transféré. Mais pour mes protéines, je n ai aucune bande supérieure à 200kda. Evidement après incubation avec mon AC, je n ai pu rien révéler. Cependant, la b actine est tres bien révélée (beaucoup même, car j ai dû loader une quantité très élevée de protéines). Donc, je pense que :
1- Le transfert n’est pas mis en cause
2- Mes protéines ne sont pas dégradées
Mais alors, où se trouve le problème ? Que dois-je faire ? SVP, aidez-moi !!!!!
Merci encore pour vos suggestions.

[Flyingbike]

pour ma part je ferais exactement comme Svenn le propose : un dot blot, pour vérifier que déjà tes protéines sont dans l'extrait. (dans la mesure ou actuellement tu n'as pas de bandes non spécifiques avec ton ac)

[invitec0b62935]

Pour les "transferts à problème", j'utilise un système de transfert à sec (on utilise le iBlot 7-Minute Blotting System, je ne sais pas si il y a d'autres produits équivalents chez leurs concurrents) ce qui améliore pas mal les choses au-delà de 150 kDa.

Le dot blot marche donc c'est plutôt bon signe, même si ça n'exclue pas tous les artefacts possibles liés à ton anticorps. S'agit-il d'un anticorps polyclonal ou monoclonal directement dirigé contre ta protéine ou d'un anticorps dirigé contre une étiquette que tu as ajouté ? Quand tu utilises cet anticorps, tu ne vois pas ta protéine mais vois-tu d'autres bandes plus petites ailleurs sur le gel ? Si tu vois des bandes plus petites, s'agit-il d'une bande unique (dans ce cas, il s'agit probablement d'une reconnaissance non spécifique d'une protéine qui n'a rien à voir) ou de plusieurs bandes et en particulier de bandes proches les unes des autres (dans ce cas c'est sans doute une dégradation partielle) ?

[invite0d3258c2]

Bonjour à tous

Questions particulières à Svenn

Svenn, mon AC est polyclonal, cependant il est très spécifique et ne reconnait que ma protéine.
Je n’ai aucune bande puisque je n’ai pas ma protéine sur la membrane. Vu que le dot blot marche très bien, je pense que l’AC n’est pas en cause.

Ces dernières semaines j’ai essayé plusieurs méthodes de transfert d’après les conseils du service technique de BioRad, mais sans succès. Ils sont prêts à nous prêter l’appareil de transfert à sec. Vu que ceci est mon dernier recours, je n’aimerais pas le rater.

Sil te plait, Svenn, peux tu me donner tous les détails :
1-Préparation du gel
2- Composition exacte de ton tampon de migration + temps et voltage de migration
3-Membrane utilisée (Nitro ou PVDF) + Traitement de la membrane avant le transfert (dans quel tampon équilibres-tu le gel, la membrane) ?
4-Pour le transfert proprement dit, tu m’avais dis qu’il n y avait pas de tampon et que les conditions étaient déjà pré-établies, peux tu STP regarder sur ta machine et me dire quelles sont ces conditions (temps, voltage ou ampérage).

J’attends tes réponses, que j’espère me sauveront la vie
Merci encore

Diane

[invitec0b62935]

On fait les gels nous-mêmes. Pour les grosses protéines, j'utilise 10% acrylamide, 375 mM Tris 8.8, 0,1% SDS, 0,05% APS, Temed pour le gel de séparation.
Le tampon de migration est un tris 25 mM, glycine 250 mM, SDS 0,1%. Je migre à 200 V jusqu'à ce que le front de migration arrive en bas.
On utilise des membranes de PVDF activés à l'éthanol. Le méthanol est plus efficace mais nous l'avons éliminé en raison de sa toxicité.
Les temps/voltage/ampérage optimaux pour le transfert sont dépendants du système que tu utilises, ça n'a pas de sens de prendre les mêmes paramètres pour des systèmes différents. Le mieux est de suivre exactement les recommandations du constructeur.


Si tu ne vois aucune bande sur ton gel, c'est qu'il n'y a probablement pas de dégradation (ou alors une dégradation tellement massive que tous les fragments seraient tellement petits qu'ils seraient sortis du gel mais avec un 10% ce serait surprenant).

Donc à priori, tu as de la protéine, elle est sans doute intacte, sa taille n'est probablement pas un problème majeur puisque des bandes de marqueur plus grosses sont transférées et le WB est tout de même négatif... Pas simple ! J'ai une autre idée : sauf erreur de ma part, ta protéine vient d'un extrait cellulaire eucaryote. J'ai déjà vu un problème similaire au tien avec une protéine de taille comparable. C'était lié au fait que l'extrait est très dense notamment en lipide et en conséquence, le tampon de Laemmli n'était pas assez efficace pour lyser totalement les membranes. Certaines protéines notamment les plus grosses et les membranaires restaient alors piégées, elles restaient donc tout en haut du gel (dans le gel de concentration) et le WB était donc systématiquement négatif. Si tu es dans cette situation,tes échantillons doivent être fortement turbides et par ailleurs ils doivent extrêmement visqueux voire carrément pateux et le chargement doit être particulièrement difficile. On a résolu le problème en augmentant la concentration en SDS du Laemmli de 1% à 2 ou 3%.

[invitebac0964c]

Bonjour Diane, as-tu trouvé une solution a ce problème.
Je fais aussi un WB pour la même protéine et je te serais reconnaissant si tu partage cette expérience avec moi.
Merci d'avance.

[Flyingbike]

Le transfert n'est pas forcément l'étape à optimiser.

Personnellement je sors très bien la FAS (genre en 1 seconde), gel standard (meme 10%), dépôt de 20 ou 30µg et transfert semi sec en 20 minutes. Avez-vous un bon contrôle positif ? De quel échantillon partez vous ?