Bonjour
je dois doser par Western blot les proteines suivantes ;Fatty acid synthase ( FASN) et les proteins; Insulin receptor, Phospho Insulin receptor.
Je cherche un protocole sur lequel je pourrai m appuyer et surtout des références des anticorps qui marchent bien pour ces protéines.
Comment preparer le lysat provenant du foie de souris?
Merci pour votre aide
Diane
Bonjour
Je peux t'aider, mais je n'ai pas le protocole d'extraction sous la main.
En gros pour faire c que tu veux faire, il faut un tampon classique d'extraction (Tris, Nacl, Triton, quelques inhibiteurs de phosphatase et de protéases). La difficulté est due a la taille de la FAS (230kDa je crois) donc il faudra faire un gel peu concentré (genre 8%) pour celle la et un plus concentré pour IR (10 ou 12%). Je suggère deux contrôles (a jeun et nourri) pour vérifier l'induction de la Fas et de la phosphorylation de IR.
Je peux te trouver des références mais encore une fois il faudra attendre lundi.
bon week end
Merci beaucoup pour ta reponse. J attends donc impatiemment le protocole lundi. Tu me sauveras la vie. Ce serait cool si tu pouvais me l envoyer directememt sur mon mail: #### : adresses mails interdites sur le forum
Merci encore
Diane
Voila le protocole
Si il faut des précisions, je peux te répondre.
extraction de protéines totales.pdf
Pour les AC
Anti FAS : http://www.cellsignal.com/products/3189.html
anti IR : http://www.cellsignal.com/products/3020.html
phsopho IR : http://www.cellsignal.com/products/3026.html ou http://www.cellsignal.com/products/3023.html (2 sites de phosphorylation)
Mais qui sont Nathalie et Antoine ?
H u m a n i t y
j'aurais pu le supprimer
c'est les techs qui préparent les sauces.
Merci pour les protocoles. C’est tres gentil. Mais pour les lysats, je ne parlais pas de cellules en culture, mais de fragment d’organes. Il s agit du foie de souris. As tu un protocole?
Pour le western en question, as tu un protocole detaillé? Car sur les sites que tu m’a envoyés, ils donnent des ref d articles, mais ces derniers sont succints, ils ne décrivent pas très bien ce qu ils ont fait. Le problème avec les AC, c est d’arriver a repoduire exactement un protocole qui marche, sinon, ils marcheront pour certains expérimentateurs et pas pour d’autres. Si tu as un protocol bien detaillé, ca m’aiderait beaucoup
Merci encore
Pour les extraits, j'utilise ce protocole sur du foie et sur des cellules, ça revient au même. Il faut faire attention a ne pas mettre trop de tissu dans le tampon, l'idéal étant de peser environ 30mg pour voir ce que ça fait. Grosso modo, une tete d'allumette dans 500µL et tu as de quoi faire des centaines de western. Il faut bien veiller a broyer correctement le tissu. J'utilise un piston conique qui a la forme d'un tube eppendorf pour broyer directement dedans. Ensuite passage par aiguille 4 ou 5 fois.
Pour les western, je n'ai pas de protocole détaillé, de toute façon il y a tellement de paramètres qu'il vaut mieux essayer par toi meme. As tu déjà fait des western ?
Oui, jai eu a en faire, mais il ya 5 ans maintenant!!!! Pour l`AC phospho IR, Cest celui de lapin que tu m as donné, ca marche aussi chez la souris?
Merci de ta reponse
rabbit veut dire qu'il est produit chez le lapin, donc il faut utiliser un secondaire anti lapin. Sinon celui-ci reconnait la forme humaine, je me suis trompé de référence. Je regarde demain.
Si tu as des collègues qui font du WB, le mieux c'est de faire comme eux avec tes propres anticorps, ce n'est pas un WB difficile a faire sortir, et éventuellement modifier le protocole si ça ne marche pas.
oui, je me ferai aider. Mais avant j ai quand meme besoin d un protocole.Le probleme c’est que je pars de rien. Dans le labo, ils ont dosè d autres proteines, pas celles la. De plus, ils le font souvent sur des cellules en culture. Cest pour cela que je suis un peu perdue. J’attens ton message demain.
Merci
En fait apres avoir creusé auprès de spécialistes de la signalisation insuline, il est plus simple et plus efficace de précipiter le récepteur et de faire un WB anti phosphotyrosine.
En fait, tes solutions stock pour le tampon de lyse, a quelle temperature sont-elles stockées? A temperature ambiante ou a 4°?
NaCl, Tris, EDTA, triton c'est a température ambiente, le reste a -20
salut
Tu utilises ce protocoles quelque soit les protéines que tu veux voir en western?
Ca m'a l'air pariculierement long 1h a 4°C il y a une raison précise a ce temps d'incubation?
YOyo
Bonjour
J'ai encore une petite question: dans quelle solution se dissolvent l' orthovanadate de sodium et l'EDTA? Je n'arrive pas à les dissoudre.
Merci de ta réponse
EDTA est assez difficile a dissoudre, il faut souvent ajouter un peu de soude, mais en vérifiant le pH pour ne pas trop qu'il augmente
L'orthovanadate est peu soluble, il ne faut pas trop le concentrer (36,8mg/mL)
Pour le temps a 4°, je sais c'est beaucoup, c'est un "vestige" d'un ancien protocole. Ca ne change pas beaucoup de laisser quelques minutes.
bonjour
Ton protocol m’abeaucoup aidé. J’ai extrait mes proteines et fais mon dosage de Bradford . Par contre, jai un soucis, mes proteines sont très concentrées. Du coup, pour avoir les 20µg qu’il faut pour le gel, j’ai des valeurs negatives. Que faire dans ces conditions? Est–ce que je peux diluer mes ech? Et si oui, comment pourrais-je les quantifier a la fin?
Merci encore
Ton protocol m’abeaucoup aidé. J’ai extrait mes proteines et fais mon dosage de Bradford . Par contre, jai un soucis, mes proteines sont très concentrées. Du coup, pour avoir les 20µg qu’il faut pour le gel, j’ai des valeurs negatives. Que faire dans ces conditions? Est–ce que je peux diluer mes ech? Et si oui, comment pourrais-je les quantifier a la fin?
Merci encore
Bonjour
c'est une erreur fréquente, la peur de ne pas mettre assez de tissu
des valeurs négatives ça n'est pas possible, à la limite que tu doives pipeter des très petits volumes ok, et en effet ça n'est pas idéal.
De combien sont tes concentrations ?
un stock entre 2 et 10 est confortable. Tu peux diluer avec le même tampon qui a servi a l'extraction. D'ailleurs pour déposer en western, vu qu'il faut le même volume partout, il faut prélever une quantité d'échantillon et compléter tout le monde au meme volume avec ce tampon, c'est donc plus pratique d'en faire plus et de le conserver.
Par rapport a la qsuantification, si tu penses que ta première quantification est correcte (c'est a dire pas trop concentré) tu peux juste diluer par in facteur X et diviser donc les concentrations par X
si les protéines étaient trop concentrées pour la quantification, il faut diluer (disons 2 ou 5) et requantifier ensuite.
Re : Western blot sur des echantillons de foie murins
Merci pour tes reponses. Je me suis trompee dans mon calcul, les valleurs ne sont pas negatives. Mes concentrations sont de l ordre de 45.000 a 130.ooo µg/mL. Je vais les diluer au 5 e et je pense que ca devrait le faire. Merci encore.
Bonjour
Encore une petite question
Pour la b actine (controle), a quel moment l’incube tu? En meme temps que l’anticorps primaire? Quelles sont les conditions?
Par rapport aux ref des AC que tu m a envoyées, les as tu utilisés? Marchent ils correctement/? A quelles dilutions?
merci encore
Encore une question, peux tu me donner les refs de l’anticorps 2 aire (Revelation ECL) et de la b actine que tu utilise? Avec les concentrations aux quelles tu as de bons resultats.
merci
Bonjour
Encore une: Que se passe t-il lorsqu'on load des concentrations élevées de protéines? Est-ce que: la migration, le transfert et la révelation se font quand même? Ou bien la concentration de protéine est-elle très importante dans les puits?
Y a-t-il une différence entre laisser incuber son anticorps 1aire pendant 2h et overnight? Est-ce que le signal s'emplifie en fonction du temps d'incubation avec l'anticoprs corps, ou bien est-ce que c'est une réaction qui a lieu au bout d'un certain temps (notamment 2h) et qui s'arrête ensuite?
Désolée de ces questions qui vont peut-être vous paraître triviales, mais je suis novice...
Plus personne? j attends des reponses, SVP.
Encore une: Que se passe t-il lorsqu'on load des concentrations élevées de protéines?
Ben déjà sur du foie ça peut être assez visqueux et ensuite il ne vaut mieux pas trop charger, ça peut perturber la révélation
Est-ce que: la migration, le transfert et la révelation se font quand même?
oui, mais ça peut ne pas être très beau
Y a-t-il une différence entre laisser incuber son anticorps 1aire pendant 2h et overnight?
Ca dépend des anticorps, moi je n'ai jamais eu de différence
Est-ce que le signal s'emplifie en fonction du temps d'incubation avec l'anticoprs corps, ou bien est-ce que c'est une réaction qui a lieu au bout d'un certain temps (notamment 2h) et qui s'arrête ensuite?
Les anticorps sont assez affins pour leurs épitopes, une fois que c'est fixé ça ne doit pas bouger. EN tout cas la fixation atteint un maximum assez rapidement
Pour l'actine, j'utilise un sigma a2066 au 2000e, le secondaire est un calbiochem 141015 au 15000e.
Merci encore pour tes reponses. J’ai commandé les AC dont tu m’as donné les ref. Je devrais les avoir d’ici demain. Alors, avant de lancer mon gel, j’aimerais quand meme avoir quelques precisions encore: les as tu utilisés? A quelles dilutions marchent ils correctement?
Fatty acid synthase
Insulin receptor
et phospho insulin receptor
Merci
Pour les dilutions, FAS fonctionne au 5000é, l'insuline 1000e et le phospho il faut essayer, mais tu peux commencer a 500e.
Ils fonctionnent bien dans 5% lait, TBS-T
Merci encore. Je te tiens au courant.
