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Western blot sur des echantillons de foie murins



  1. #31
    Diane200

    Re : Western blot sur des echantillons de foie murins

    Bonjour
    Voilà, c’est fait! J’ai fais mes westerns blot. FAS et IR marchent nickel.

    Par contre, P.IR que j’ai acheté chez Cell application, n’a pas l air de marcher. Je n’ai aucune bande. Je vais essayer differentes dilutions.

    La question est celle-ci: j’ai egalement mesur é l’expression de la protein Akt1 mais j’ai un bruit de fond meme à une min dcexposition, par contre je distingue quand meme quelques bandes. Quelles peuvent en etre les causes? Que Dois-je faire pour remedier à ce probleme?
    Quelqu’un aurait-il des ref de cet AC qui marche bien chez la souris?

    Mon 2e problem: Jai strippé mes membranes après la 1ere revelation. Apres blocage de la membrane, jai incubé les ACs 1aire, 2aire etc. Mais à la revelation, plus rien! LES Memes ACs qui avaient marché à la premiere revelation ne donnent plus rien. J’ai un film vierge. Quelqu’un peut-il me dire ce qui s’est passé et que faire à l’avenir pour eviter ce genre de situation?

    PS: Notez que je recherche toujours des ACs anti Phospho Insulin Receptor
    Et anti Akt1 (souris)

    Merci de votre aide, j’attends vos conseils.
    Diane

    -----


  2. Publicité
  3. #32
    Flyingbike

    Re : Western blot sur des echantillons de foie murins

    Bonjour


    Ravi que ça ait marché au moins en partie.
    Pour pAkt, il faut essayer différentes conditions de blocage, notamment BSA et lait, et aussi changer le milieu d'incubation de l'anticorps (lait ou BSA également).

    Pour le stripping, personnellement j'ai arrête de le faire puisque ça n'a jamais été concluant (soit plus rien, soit encore du signal)
    Cependant il existe plusieurs solutions (solutions acides isotoniques, solution de ß-mercaptoethanol, etc) et certaines marchent mieux.

    Pour le pIR, si ça ne marche pas bien il faut envisager de faire des WB a partir d'échantillons immunoprécipités avec l'anticorps IR.

    Je vais voir si j'ai d'autres références

  4. #33
    Diane200

    Re : Western blot sur des echantillons de foie murins

    Merci encore pour tes reponses, mais comment immunoprécipiter mes échantillons ? As tu un protocol ? CONCERNANT LES solutions acides isotoniques, solution de ß-mercaptoethanol, As-tu des concentrations a me donner ? Comment les preparer et laquelle marche le mieux ?
    Merci encore

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