Bonjour, bonne année,
j'essaye de mettre au point une extraction d'ARN sur des échantillons d'urine. Mon seul soucis, c'est que la quantité récupérée avoisine les 3ng/µl... Travaillant d'habitude sur des cellules, je n'ai pas l'habitude de travailler avec des prélèvements tels que l'urine...
Quelqu'un peut-il m'aiguiller vers un protocole?
Merci beaucoup.
Vous n'avez jamais imaginé que si vous n'avez pas d'ARN, c'est parce qu'il n'y a pas (ou peu) de cellules dans les urines ?
Je considère tout à fait normal de ne récupérer que peu d'ARN dans un milieu presque acellulaire.
Si vous tenez vraiment à analyser l'ARN (de quelle facon d'ailleurs ???), il faudra travailler sur de grands volumes, récupérer le peu de cellules (par ex en centrifugation) avant l'extraction.
En parlant de centrifugation, j'ai centrifugé à 14000g, pendant 30minutes (trop fort!!!) puis à 400g pendant 5minutes (ce que j'ai pu trouver dans la littérature), je voulais surtout savoir si quelqu'un l'avait déjà fait et quelle centri serait la + adaptée (vitesse de rotation, temps...)
c'est laaaargement suffisant pour descendre les cellules, s'il y en a. Vous devriez faire un comptage pour voir combien vous avez de cellules (ou une mesure de la quantité d'ADN avec une technique très sensible). A mon avis le problème ne vient pas du protocole mais de la pauvreté en matériel.
Merci, c ce que je pensais aussi....
Je vous remercie.
Tu devrais déjà préciser quelle méthode tu as utilisée pour extraire l'ARN, à la limite recopie les grandes lignes du protocole ici.
J'ai jamais travaillé sur de l'urine mais j'ai vu récemment qu'il y avait assez de cellules dedans pour générer des cellules iPS (http://www.nature.com/nprot/journal/...d=NPROT-201212) donc il doit y avoir un peu de matériel
-Comme dit au dessus, 400-500g pendant 5 à 10 minutes c'est assez pour faire descendre les cellules.
-Précautions de base quand tu veux bosser avec de l'ARN, enfin je penses que tu sais déjà ca: instruments et réactifs RNAse free, garder au max les cellules au froid tant que t'es pas dans un milieu (eg trizol) adequat pour éviter la dégradation de l'ARN
-Comme dit au dessus, vérifie la quantité de cellules dans ton matériel de départ
Avec les kits disponibles aujourd'hui c'est possible d'avoir assez d'ARN pour bosser à partir de très peu de cellules, renseignes toi chez les fournisseurs habituels de ce type de kit d'extraction.
J'ai lu qu'on pouvait ajouter du glycogéne pour améliorer la précipitation...
Avez vous des infos la dessus?
Oui tu peux ajouter du glycogène (je ne sais plus à quelle étape de l'extraction mais fouille un peu tu devrais trouver). Enfin le fait que tu dises ca me laisse penser que t'essaie de faire une extraction trizol "à l'ancienne", avec peu de matériel de départ c'est pas franchement l'idée du siècle.
Ca coute un peu cher mais les kits d'extraction spécialement concus pour petite quantité d'arn sont la meilleure solution dans ton cas à mon avis.
il y a des kits spéciaux pour les petites quantités comme le dit random_postdoc. Ca coute cher mais tu peux partir de quelques dizaines de cellules. (faut compter en moyenne 5 euros par point...)
Sinon le glycogène peut aider, surtout a agglomérer le culot et à le visualiser. Il s'ajoute dans le tube juste avant la précipitation (AcNa et EtOH ou isopropanol).
En fait, je fais une extraction phénol-chloroforme associée au kit RNeasy....
Aprés la lyse avec phénol-chloroforme, je précipite une nuit avec de l'ETOH et après je passe sur les colonnes... La question que je me pose, c que si j'utilise du glycogène, il n'y a pas de soucis lors du passage sur colonnes???
Ensuite, je ne peux pas utiliser d'autre kits...
pourquoi ne pas simplifier le protocole et passer directement sur les colonnes ? je ne vois pas l'intérêt du phénol chloroforme en amont, surtout que mettre l'ARN précipité dans l'éthanol sur les colonnes ne doit vraiment pas aider.
Ce protocole, je l'utilisais quand j'extrayais l'ARN de tissus et ca me donnait de bons résultats.... J'ai voulu garder le phénol- cholroforme, car le tampon de lyse du kit ne me convenait pas...
Pour quelle raison ?Envoyé par tech31
Vous rajoutez une étape (non nécessaire selon moi) qui constitue une occasion supplémentaire de perdre du matériel. Vous devriez essayer de lyser le culot de cellules dans le tampon fourni et de suivre le protocole, si ça se trouve le problème sera résolu.
Avant j'extrayais l'ARN sur tisssus et pour lyser, j'utilisais le phénol -choroforme, quand je suis repassé sur cellules, j'ai testé le phénol-choroforme/kit RNeasy vs kit RNeasy, j'avais + en quantité et l'arn de meilleure qualité, du coup je suis resté avec ce protocole...
