Isoler une région d'un génome à partir d'un BAC

[inviteb7174662]

Re - bonsoir,

Bon c'est ma soirée des questions ( ) (d'autres questions suivront sans doute, d'ailleurs

Alors, ici, je voudrais votre avis :

Mon problème : Je veux isoler une région de quelques Kb, englobant un gène d'intéret, à partir d'un BAC dont la séquence est connue.

Ce que je propose (succintement):
- Fragmentation du génome par hydrolyse partielle grâce à Sau IIIA.
- Insertion des fragments dans BAC
- Transformation
- Criblage pour sélectionner les transformants portant mon gène d'intéret.

Qu'en pensez vous ? Y'a t'il une meilleure méthode ? J'ai également quelques lacunes sur les méthodes de criblage, (repérage par sonde marquée ?)

Merci d'avance.
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[invitea0443c8c]

Salut!
C'est la méthode du Shot Gun inventée par Craig Venter et ça marche très bien pour les génomes procaryotes mais par contre c'est beaucoup plus délicats pour séquencer entièrement un génome eucaryote (car tu as des exons/introns, des promoteurs alternatifs, et pleins d'autres trucs bizarres ).
Tu peux utiliser la méthode du finger print : tu fragmentes, tu clones dans les BAC et ensuite tu fais une restriction avec une enzyme et tu compare les profils de restriction de tous tes BAC avec un BAC de référence.... Tu peux également utiliser la méthode des STS. Les STS peuvent être n'importe quel séquence sur ton gènome à condition que ce soient des séquences uniques. Tu fais ensuite des PCR pour amplifier ces STS et tu testes chaques paires de primer (correspondant à chaque STS) sur chaqun de tes BAC. Tu obtiens un continguage de tes BAC. Pour vérifier tu peux également utiliser les hybrides d'irradiation dans les cellules CHO : tu fragment ton ADN avec des doses d'UV variables. Ensuite tu récupères les fragments et tu les mets dans des cellules CHO pour qu'il y ai recombinaison et pour obtenir des clones cellules CHO contenant des fragments venant de ton génome fragmenté. Plus la dose d'irradiation est forte et plus tu as des chances de séparer 2 fragments proches sur ton génome. Donc si tu retrouve par exemple 2 séquences hybridée toujours l'une à coté de l'autre dans tes cellules CHO et ce, même avec de fortes doses d'irradiation aux UV, c'est qu'il y a de fortes chances pour que tes séquences soient cote à cote dans ton gènome initial.
Pour combler les GAP entre 2 contigues, tu peux enfin utiliser la Double approche PCR. C'est un peu long à expliquer et peut-être que tu connais mais n'hésites pas si tu veux des précisions....

Le séquençage des génome est une discipline très complexe et les concepts sont parfois difficile à cerner!

A+
Vinc

EDIT : ce n'est pas la méthode du Shot Gun. Dans ta métode tu n'as pas dit où tu séquencais? Il faut séquencer tes BAC à un moment pour pouvoir les aligner....

[inviteb7174662]

Ah merci pour ta réponse Vinc.
Le séquençage des génômes m'intéresse et je ne maitrisais pas tout ce que tu m'as appris dans ton post.
En revanche, dans mon cas précis, je voudrais isoler une région précise d'un génôme, à partir d'un BAC, (et non pas séquencer le génome )

En d'autres termes, comment faire pour isoler une région de 10 kb environ, (amont du gene d'intéret + gene d'intéret + aval) à partir d'un BAC ( on connait la séquence complète du BAC ) .


Donc ce quej'ai dit plus haut semble juste non ?:
- Fragmentation génome
- Insertion dans BAC
- Transformation
- Criblage

Et pour le criblage, j'avoue que je ne sais pas trop.
Je précise : en fait, je veux isoler une séquence d'ADN (7kb) de souris autour du gène MOP3 (protéine impliquée dans l'horloge biologique). (7,5kb)
J'ai aucune idée pour sélectionner les transformants qui portent mon gène de MOP3.
Ensuite pour isoler la séquence, après je pense qu'une PCR fera l'affaire, n'est ce pas?

[invitea0443c8c]

Bon alors si j'ai bien compris (parce que j'ai tout lû Freud , les initiés comprendront...), en fait tu veux repérer une séquence parmis une banque de BAC? C'est ça? Donc en fait ta question c'est comment détecter spécifiquement ton gène dans ta banque? Si c'est ça, tu peux contruire, par exemple, 3 couples de primers qui encadrent (pour chaque couple) 3 petites régions sur la zone que tu veux détecter : un couple en 5', un autre en 3' et un dernier couple de primer au milieu de la zone. Ensuite tu testes chaque couples sur tout tes BAC (oui je sais ça fait beaucoup de manip), c'est à dire que tu fait une PCR pour chaque couple de primer pour chaque BAC de ta banque. Et ensuite tu sélectionne le BAC qui est positif pour les 3 (oui j'ai bien dit les 3 et pas seulement 1 ou 2) couples de primers. Pourquoi? Parce que si c'est positif pour les 3 ca veut dire qu'avec ta PCR tu a réussit à amplifier ta séquence en 5', celle en 3' et celle au milieu du gène donc ça veut dire que ton BAC contient bien l'ensemble de la zone recherchée. Si une PCR est négative, c'est que la BAC ne contient pas la séquence à amplifier. Donc il faut que tu fasses attention à dessiner tes primers bien au bord de ta zone d'intérêt.

Bon voila, je pense que ça serait une solution de criblage mais certainement pas la seule....
Je ne suis pas bien réveillé, pour toute te dire je dors même à moitié donc si je n'ai toujours pas compris ton problème, dis me le et je tacherai d'être plus attentif (je serais plus opérationnel demain)!
Pour l'heure

A+
Vinc

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb7174662]

Non, ce coup ci, je crois que c'est bon
C'est une solution judicieuse (les 3 couples d'amorces), que je n'aurai jamais trouvé tout seul, je crois
Je séchais vraiment.
Si tu as une illumination d'une autre technique de criblage dans la nuit, n'hésite pas (mais celle ci me convient tout à fait ^^).

Merci pour ton aide,
Je te souhaite une bonne nuit.

[invitea0443c8c]

Je t'en prie....
C'est une technique dérivée du séquençage... Mais je vais essayer d'en chercher d'autres!

A+
Vinc

EDIT: et bonne nuit également

[invitec9f0f895]

Salut

Le probleme du criblage de BAC par PCR viens notamment du tres grand nombre de clone que tu vas devoir repiquer et analyser en PCR! ca va etre long. Une technique plus rapide et tout aussi efficace est d'effectuer une replique de tes colonies sur une membrane et d'effectuer une hybirdation avec une sonde radioactive (ou froide) spécifique de ton gène d'interet. Cela va deja te permettre d'identifier les colonies possédant un BAC avec ta region d'interet. Ensuite seul le sequençage te permettra de t'assurer que tu as l'integralite du gene recherché, car comme il proviens de la souris tu travailles tres probablement avec une banque de BAC contenant du cDNA et tu n'es jamais a l'abri de problemes techniques lors de la reverse transcription (ou que tu ARNm soit epissé alternativement, ou possede plusieurs initiation/termination transcriptionelle.)

Yoyo

[inviteb7174662]

Ah bien vu Yoyo, une hybridation sur colonies pour limiter le nombre de BAC ( Je connais cette technique, mais pourquoi n'ai je pas penser à l'utiliser grmbl )

Et bien, c'est génial, merci à vous deux.
J'y vois un peu plus clair maintenant.
Pas facile d'apprendre à maitriser tous les outils Et de penser à les combiner pour allèger le nombre de manips.
J'espère que ca viendra avec l'expérience.

[invitea0443c8c]

Salut!

une hybridation sur colonies pour limiter le nombre de BAC ( Je connais cette technique, mais pourquoi n'ai je pas penser à l'utiliser grmbl )

Je peux en dire autant....... !En fait j'ai été "captivé " par le terme BAC et j'ai ramené ça aux techniques de séquençage mais c'est se compliquer la tâche car un criblage classique convient, en effet, parfaitement.
A+
Vinc