Quantification d'ADNc après une reverse transcription

[invite573f7f25]

Bonjour à tous!

J'avais un certain nombre de question concernant un problème récurrent de dosage de mon ADNc (via le Kit Quant-it oligreen) :
Lorsque je mets 1000ng d'ARN totaux en début de Reverse transcription (oligo-dt, pas de random primer), je récupère 300 ng ADNc d'après le dosage du kit Quant-it. Sachant que toutes les autres équipes auxquelles j'ai parlé ne quantifient pas et considèrent que l'on récupère autant d'ADNc que d'ARN (par exemple si on utilise 1000ng d'ARN ils considèrent que l'on récupère 1000ng d'ADNc), ça me parait bien faible.

Du coup j'avais un certain nombre de questions sur ce sujet :

-La quantification au nanodrop est souvent exclue parce que les amorces et les dNTP faussent la valeur. Mais si l'on fait le blanc avec un mélange d'oligo et dNTP équivalent à celui dans lequel l'ADNc est en solution, est ce que ça ne rectifie pas grossièrement ce biais?

-Sachant que les ARNm ne représentent qu'une petite partie des ARNs totaux (10% chez les eucaryote si je me souviens bien) pourquoi s'attend-t-on à récupérer à la fin de la reverse transcription autant d'ADNc que d'ARN totaux en utilisant des oligoDt?

-Est ce que quelqu'un d'autre utilise ce kit (Quant-it oligreen), et si oui avez vous déjà rencontrer des problème similaire avec?

-Une dernière chose, un peu tiré par les cheveux, c'est vrai... Quand je fais mon dosage oligreen avec ce kit, la fluorescence de la gamme descend BEAUCOUP plus vite que celle de mes échantillons, est ce normal?
Du coup si je fais une lecture de la même plaque à 5min, 30min et 1h30. J'obtiens des quantité d'ADNc de 277, 527 et 736ng respectivementpour le même puits...

Merci d'avance pour votre aide!
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[Flyingbike]

-Sachant que les ARNm ne représentent qu'une petite partie des ARNs totaux (10% chez les eucaryote si je me souviens bien) pourquoi s'attend-t-on à récupérer à la fin de la reverse transcription autant d'ADNc que d'ARN totaux en utilisant des oligoDt?

Ca, c'est une légende de laboratoire colportée par des scientifiques qui réfléchissent peu

J'ai une question : pourquoi vouloir doser vos ADNc apres RT ?

[invite573f7f25]

Car nous déposons 5ng d'ADNc par puits dans nos plaques de qPCR

[Flyingbike]

pourquoi ne pas se baser sur la quantité d'ARN alors ?

Ici, nous déposons le produit de reverse transcription correspondant à l'équivalent de 5ng d'ARN, et ça fonctionne très bien.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite573f7f25]

quelques petites questions supplémentaires alors :

Sur quel type de cellule travailles-tu?

Quels gènes de ménages utilises-tu et aux alentours de quels Ct sortent-ils pour 5ng/ARN initial par puits?

[random_postdoc]

pourquoi ne pas se baser sur la quantité d'ARN alors ?

Ici, nous déposons le produit de reverse transcription correspondant à l'équivalent de 5ng d'ARN, et ça fonctionne très bien.

Voilà, c'est pas nécessaire de se prendre la tête et procéder comme ca est très bien si tes amplifications sortent à un nombre de cycle correct.

Sinon la RT est évidemment pas efficace à 100% et plus tu concentres ton ARN dans ton mix de réaction moins l'efficacité sera bonne en général. Là 1µg ca me semble être un gros paquet. J'ai l'habitude de plutôt travailler à partir de 100ng d'ARN même si les protocoles standard recommandent plus, et ca fonctionne très bien en général.

[Flyingbike]

quelques petites questions supplémentaires alors :

Sur quel type de cellule travailles-tu?

Quels gènes de ménages utilises-tu et aux alentours de quels Ct sortent-ils pour 5ng/ARN initial par puits?

Type cellulaire : HepG2, hépatocytes primaires, tissus variés (foie, muscle, intestin, cerveau, tout est bon dans la souris)

Te donner le CT comme ca n'a pas trop de sens, mais avec 6,25ng, un gène fortement exprimé sort a 10-12.

J'ai arrêté de normaliser avec un gène de ménage (ca n'a aucun sens à mon avis). En théorie, le fait de partir d'une quantité d'ARN constante est une normalisation suffisante.

Voilà, c'est pas nécessaire de se prendre la tête et procéder comme ca est très bien si tes amplifications sortent à un nombre de cycle correct.

Sinon la RT est évidemment pas efficace à 100% et plus tu concentres ton ARN dans ton mix de réaction moins l'efficacité sera bonne en général. Là 1µg ca me semble être un gros paquet. J'ai l'habitude de plutôt travailler à partir de 100ng d'ARN même si les protocoles standard recommandent plus, et ca fonctionne très bien en général.

Ca dépend du système utilisé, du volume et de l'enzyme. Par exemple une Superscript II fonctionne très bien même au dessus de 2 µg dans 20µL.

[invite573f7f25]

Merci à tous pour votre aide. j'ai fait mes qPCR en me basant malgré tout sur le dosage des cDNA (comme dirait l'autre, parce qu'on a toujours fait comme ça...) et tous mes gènes sortent avec 1-2Ct de moins. Donc bon, léger gâchis de matériel, mais ça marche... Je me demandais d'ailleurs si c'était possible de rater une qPCR si l'on dépasse une certaine quantité de cDNA par point?

En tout cas pour les manips futures, je suis bien tenté d'appliquer la méthode de 5ng d'ARN initial par point. Mesurer la quantité de cDNA me parait plus introduire un biais supplémentaire qu'autre chose.

[Flyingbike]

Personnellement j'ai eu plus souvent des problèmes avec des points trop concentrés que pas assez. Trop de cDNA inhibe l'amplification.

La méthode de se baser sur une quantité égale d'ARN me parait également plus judicieuse.

Merci pour le retour et bonne manips