5' et 3' RACE

[Enialix]

Bonjour a tous,

Dans le cadre de mon postdoc, je vais très certainement devoir faire un peu de 5' et de 3' RACE.

Est-ce que l'un d'entre vous a déjà utilisé ces techniques? Avez-vous un kit en particulier a conseiller?

J'ai vu que certains kits permettent directement de tagger l'ARNm en 5' et en 3' (sur le site epibio), mais dans ce cas ce n'est pas un ARNm en particulier qui est taggué, mais bien tous les ARNm de l’échantillon c'est bien ça? L'amplification spécifique se fait alors par une PCR ultérieure en utilisant un primer a l’intérieur de l'ARNm?

Merci d'avance pour votre aide,
Enialix
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[Enialix]

Pas d'adeptes de la bio mol?

[Flyingbike]

si plein, mais je crois savoir que ces techniques pas très courantes et pas très récentes dépassent pas mal de monde.

Bonne chance en tout cas !

[jmbowie]

Salut,

La "taggage" ne se fait pas directement sur l'ARNm mais à partir d'ADN complémentaire que tu as synthétisé soit en ciblant un ARN en particulier soit en utilisant des "random hexamers" qui permettent en principe la rétrotranscription de tous les ARNm.
C'est une fois que tu as l'ADNc, et éliminé les ARN résiduels, que tu le traites pour lui ajouter une queue polyC ou G

[A voir en vidéo sur Futura]

[Enialix]

Merci de vos réponses.

@ Flyingbike, tu dis que ces techniques ne sont pas très courantes et pas très récentes, connaîtrais-tu d'autres techniques permettant d'amplifier les régions 3' et 5' (pour les séquencer par la suite)?

@ jmbowie, je faisais référence a ce lien http://www.epibio.com/images/default...30204435711874 ou ils expliquent que grâce a leur kit, on peut obtenir des ADNc marqués en 3' et en 5'. L'un se fait directement sur l'ARNm, et l'autre sur l'ADNc. C'est pour ce cas particulier que je demandais si tous les ARNm allaient être marqués.

[johnkitt]

Bonjour Enialix

J'ai fait de la RACE en début d'année (sur ARN d'anthères). Je me suis basé sur la publication de Scotto-Lavino et all., 3'end cDNA amplification using RACE.
Je n'ai fait que la 3'RACE, qui a bien foncionné alors qu'on avait très peu de matériel au départ.
J'ai utilisé le kit RevertAid H Minus Reverse Transcriptase de ThermoScientific, et la DreamTaq pour les PCR sur cDNA.

Bonne journée,
Jonathan.

[jmbowie]

Moi je n'ai fait que de la 5'RACE sur ARN bactérien, c'est faisable sans kit mais 2 choses très importantes c'est que (i) ARN non dégradés et (ii) une expression pas trop faible. Ha et pour ton kit il semble que tous les ARN soit marqués en effet

[Enialix]

Merci pour vos réponses.

Jonathan, je vais jeter un coup d'oeil a ton kit, j'ai également peu de matériel.

jmbowie, c'est noté, je ferai ça sur des ARN fraîchement purifies pour éviter toute dégradation.