Race PCR

[invite563835f6]

Bonjour à tous,

J'ai trouvé ce schéma http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshel...igure&id=A2574 qui explique la 5'RACE PCR et la 3'RACE PCR sur internet, mais je ne comprends toujours pas le but de la manipulation.

D'après mon cours, cette méthode permet de déterminer les extrémités 3' et 5' des ARNm, mais je ne vois pas comment en pratique cette méthode le permet.

Si j'ai bien compris, pour la 5' RACE PCR:
- On ajoute une RT avec une amorce antisens interne qui se fixe à l'ARNm (on essaie d'en prendre une qui sera le plus proche de l'extrémité 5' de l'ARNm)
- On ajoute une queue polydA à cet ADNc antisens avec la terminal transférase
- On récupère l'ADNc antisens avec sa queue polyA et on fait une RT avec une amorce sens oligodT et une extension non hybridée ("anchor primer" = primer d'anchois ? )
- On complète l'ADNc antisens pour qu'il s'hybride parfaitement avec l'extension précédente ("anchor primer"). => COMMENT FAIT ON CA EXACTEMENT ?
- On fait une PCR avec pour amorces: "anchor primer" et l'amorce antisens interne utilisée au début.

Mais qu'est ce que cela va nous donner exactement ? On fait migrer le produit PCR obtenu sur gel ? On le séquence ?
Je pense que mon problème vient principalement du fait que je confonds extrémité 5' et début de traduction globalement.

Pour la 3' RACE PCR c'est le même principe, mais la queue polyA est déjà présente.
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[invite71f23525]

Salut,

Tu te compliques trop la vie!

"Anchor primer" c'est plutôt "primer d'ancrage", c'est le primer qui va se fixer sur la queue polydA. Cette queue est créée avec la TdT afin d'avoir une séquence connue en 5', en amont de la séquence de l'ADNc, pour pouvoir choisir une amorce spécifique et ainsi ne pas perdre la partie 5' de l'ADNc lors de la PCR qui suit.

- On complète l'ADNc antisens pour qu'il s'hybride parfaitement avec l'extension précédente ("anchor primer"). => COMMENT FAIT ON CA EXACTEMENT ?

....En se servant de l'amorce polydT, d'une Taq polymérase et de l'ADNc antisens comme matrice...Donc c'est une PCR tout simplement. Lors du premier cycle, on aura bien entendu que la synthèse du brin sens de l'ADNc. Lors du cycle suivant, brin sens et antisens sont amplifiés, et là la polymérase "complète l'ADNc antisens pour qu'il s'hybride parfaitement avec" l'anchor primer. C'est le schéma classique de la PCR, la polymérase copie par complémentarité jusqu'à la fin de la séquence matrice....

Mais qu'est ce que cela va nous donner exactement ? On fait migrer le produit PCR obtenu sur gel ? On le séquence ?

On fait ce qu'on veut! Ici c'est "rapid amplification of cDNA end", donc c'est uniquement cela qui est explicité. Généralement, le but est de déterminer la séquence 5' inconnue d'un ADNc (et de là de l'ARNm dont il provient). Donc ensuite on peut prendre le produit de la PCR que j'ai rapidement expliquée ci-dessus comme matrice, la queue poly-dT comme amorce, les 4 dNTP plus 4 ddNTP puis faire un séquençage de Sanger.
A partir la séquence 5' de l'ADNc, on peut alors designer des primers spécifiques et cloner le gène concerné. Là c'est vraiment une finalité concrète. D'ailleurs en cours j'avais appris les innombrables techniques de RACE (car y en a pas qu'une) dans le cadre de l'apprentissage du clonage moléculaire.

Je pense que mon problème vient principalement du fait que je confonds extrémité 5' et début de traduction globalement.

Si tu connais la signification de 5'-UTR (5'-UnTranslated Region : région 5' non traduite), tu ne devrais pas faire cette erreur. Le codon d'initiation n'est jamais pile à la première base de l'ADNc (en tout cas pour un ADNc absolument fidèle à l'intégralité de l'ARNm dont il provient).

Greg

[invite563835f6]

Merci beaucoup!

Donc en fait, cette technique ne permet que d'amplifier un transcrit en vue de le séquencer pour déterminer alors:
- le +1 de transcription
- le codon d'initiation
c'est bien cela ?

[invite71f23525]

Euh...oui si on veut, mais je pense que le but premier de cette technique est avant tout de cloner l'intégralité d'un gène (la partie codante bien entendu...).

A partir de la séquence intégrale de l'ARNm, on peut déterminer le codon d'initiation en effet. Dans la plupart des cas, le codon d'initiation au début de l'ORF la plus longue est le bon : voir ORF Finder sur NCBI. Les vérifications expérimentales adéquates s'imposent bien entendu.

Le +1 de transcription se détermine plutôt avec la technique d'extension d'amorce, moins lourde que la 5'-RACE (je suppose), mais j'ai complètement oubliée la fin de cette expérience là (je crois que c'est par séquençage de l'extension la plus longue...pas sûr du tout). Mais à partir de la séquence 5' de l'ADNc normalement on le connait puisqu'on n'a jamais d'intron au début d'un pré-ARNm. Si quelqu'un passe ici et qui a les souvenirs plus frais que moi sur ces techniques de bio mol, qu'il n'hésite pas!

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee863e61a]

J'arrive un peu après la bataille mais la 5'RACE est très utile pour déterminer les +1 de transcription sans passer par l'extension d'amorce (= radioactivité, exposition, etc.) Non la RACE est utile et ca marche!