Bonjour,
Je n'ai pas vraiment compris comment on fabriquait un vecteur d'expression. Je m'embrouille avec ces histoires d'enzymes de restriction et de gènes codant pour la résistance à l'ampicilline, etc...
J'espère que ce n'est pas trop demander mais est-ce que quelqu'un pourrait me résumer les étapes une à une svp ?
Tout est un peu flou, merci d'avance !
Personne n'a une petite idée ?
bonjour
un vecteur 'expression est un fragment d'ADN qui peut (ou pas selon les cas) se repliquer dans une cellule.
il doit contenir un marqueur de sélection pour sélectionner les cellules qui le possèdent (beaucoup ne l'auront pas reçu durant la transformation).
les enzymes de restrictions sont utiliser, comme des ciseaux pour couper cette molecule et y coller le gène que tu veux exprimer.
voila j'espère que ca t'aide
Yoyo
Ta question porte plus sur à quoi sert chaque constituant non ?
Oui en effet, mais je crois avoir finalement compris !
Les gènes codant pour une resistance à l'ampicilline par exemple permettent de sélectionner les bactéries qui ont reçu le transgène. Mais pour ce qui est de l'amplification pour obtenir de grandes quantités de plasmide, c'est tout bête mais l'origine de réplication permet de répliquer le vecteur dans une même bactérie ou bien chez les cellules filles aprés mitose ?
Autre chose : dans mon cours j'ai écrit qu'on peut aussi détecter le transgène par PCR en utilisant un couple d'amorce spécifique de celui-ci pour amplifier la séquence d'interet par PCR en utilisant de l'ADN codant un gène murin témoin. Je ne comprend pas, si j'ai bien compris le seul fait de détecter la sequence par electrophorese devrait prouver la présence du transgène, mais alors pourquoi a t'on besoin d'un témoin ? Est-il indispensable ?
Ensuite, quand on parle de trangénèse additive en fait on injecte une multitude de vecteurs dans une cellule ? Puis ceux-ci vont s'insérer dans le génome ou rester tels quels ?Et je crois que je n'ai pas compris comment se faisait une trangénèse homologue.
Est-ce que ça consiste à supprimer un gène puis par recombinaison en se servant d'un "ADN modèle" (je suis sûre que ça porte un nom) à reconstituer les brins pour obtenir un nouveau gène ? Si oui, est-ce que cette opération ne concerne qu'un seul allèle ?
Et enfin dans un exercice on introduit un vecteur viral par voie intraveineuse et on observe que les différents tissus de l'organisme n'expriment pas la même quantité de protéine recombinante. En fait si je comprend bien on a injecté un virus portant le gène d'interêt dans l'organisme ce qui va permettre d'injecter le matériel génétique dans la cellule hôte ? Dans ce cas comment expliquer les variations observées ? Est-ce que c'est dû au fait que le virus n'infecte qu'un type paarticulier de cellule ?
Je suis désolée de toutes mes questions, la longueur du texte doit en effrayer plus d'un ^^
Merci d'avance pour votre aide !
Personne n'a une petite idée ?
bonjour,
1) le plasmide ou vecteur d'expression est doté d'une réplication autonome
2) il est possible de détecter le transgène par PCR tu connais la taille de ton insert tu choisis des amorces spécifi-
ques et tu réalises ta pcr. il est également faisable de vérifier le transgène après le clonage par digestion enzymati-
que du clone recombinant sous l'action de l'enzyme approprié tu trouves 2 fragments d'ADN ton plasmide+insert
3) Normalement quand on réalise un clonage dans une bactérie celle ci doit présenter un génotype rec- (ou recom-
binase -) comme ça l'exogène ne va pas s'intégrer dans le génome de la bactérie en plus pour exprimer des protéines la souche doit être protéase - pour ne pas dégrader le produit d'expression
4) il peut arriver que tu obtiennes des protéines tronquées c'est ce que t'as écrit (l'organisme n'exprime pas la même quantité de protéine recombinante), c'est probable des mutations spontanées peuvent apparaître lors du clonage .
J'espère que j'ai répondu à toutes vos questions
cordialement,
mkh
Mais avant tout le rôle du vecteur d'expression est d'amener le gène d'interet a l'intérieur de la cellule hote ?
