Bonjour à tous,
j'ai un léger problème avec mes échantillons, j'explique:
j'ai fait une extraction trizol + pvp1% méthode phénol-chloroforme avec des feuilles de melon broyés dans l'azote liquide, je pèse environ 50mg d'échantillons
après extraction je fais un dosage au nanodrop j'ai des quantités environ 500ng/µl
j'effectue une dnase en doublant le volume(10 au lieu de 5µl) avec un temps d'incubation d'1h
après je fais une pruification sur colonne, je perds un peu de matériels puisque le dosage me donne des quantités environ 100ng/µl
j'ai fait une RT puis une qPCR (sybrgreen) avec une gamme de dilution en cascade de 5 points (d1/2, d1/5, d1/10,d1/50,d1/100,d1/1000); mes échantillons, no rt et l'eau
Aux résultats, seuls 2 de mes points de la gamme ont amplifiés, mes no rt aussi
je ne sais pas si c'est ma Dnase qui ne marche pas ou c'est j'ai eu une contamination ultérieure en ADNg
Je ne sais plus que faire , j'ai changé plusieurs fois mon protocole extraction puisqu'il ne marchait pas trop bien et varié beaucoup selon mes échantillons
Si vous avez des conseils, ce serait la bienvenue!
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