Pcr

[invitecd71fbc7]

Bonjour,

A quoi cela sert t'il exactement de préparer le mélange réactionnel pour une PCR (tampon, oligonucléotides, ADNc, TAQ pol) sur glace? Que pourrait t'il se passer si on le le faisait pas sur glace?

Merci d'avance.
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[invitecd71fbc7]

Aussi, pour quelles raisons ajouter de l'eau à ce mélange?

[invitecd71fbc7]

Quelqu'un pour me mettre sur la voie? J'imagine que la glace c'est pour conserver des conditions optimales pour les nucléotides, mais pq sur glace alors qu'ensuite lors de la PCR ce sera chauffé jusqu'à 95°C? Et l'eau, parce que ça absorbe bien la chaleur? Ou pas?

[Flyingbike]

Cela permet notamment de presque totalement inhiber la polymérase. Même a 25°, certaines polymérases notamment les non "hot start" peuvent avoir une activité de polymérisation qui peut favoriser l'apparition de produits non spécifiques.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitecd71fbc7]

La Taq pol serait donc capable de polymériser à des températures négatives!?
Merci

[invite444a246d]

La Taq a une activité optimale à forte température, mais peut avoir un reliquat d'activité à température ambiante.

Si tu laisses ta Taq a 25°C en présence des primer, il y a un risque qu'elle se mettent a produire n'importe quoi avec les nucléotides présents.

Donc on la laisse dans la glace jusqu'au dernier moment. Quand tous les ingrédients sont dans le tube, on lance la PCR aux températures idéales, pour que le seul produit généré soit obtenu à partir de la matrice ajoutée.

Cham.

[Loupsio]

Mais la Taq pol a besoin a besoin des amorces, des dNTP et de l'ADN a multiplier pour fonctionner?
si il manque ne serait-ce qu'un des composants elle devrait ne rien faire? comment peut elle produire autre chose de non voulu?

[noir_ecaille]

En amplifiant uniquement des amorces ?

[Loupsio]

Juste avec l'amorce et les dNTP, sans que l'enzyme repose sur un morceau de double brin complémentaire?

[noir_ecaille]

Tout dépend de la complémentarité des amorces ?

[Loupsio]

Mais si les amorces s'hybrident entre elles, il va y avoir des bouts francs,
il faudrait des bouts dépassants pour qu'il y ait polymérisation

EDIT:
Ah non c'est bon je visualise
merci des précisions

[invitecbef7d3e]

Hello;
pour mes PCR en temps réel et quand je doit travailler avec de l'ARN ,je met l'ARN sur glace car contrairement à l'ADN,il se dégrade à cause de la chaleur,donc si tu ne travail pas sur glace,tu ne devrais pas trouver de bons résultats mais attention l'ADN doit être amplifié dans le thermocycleur et il supporte la chaleur donc pour amplification d'ADN pas besoin de travailler sur glace ,j'espère avoir bien répondu à ta question et que ceci pourra t'aider