bonjour,
je suis train de faire de la mise au point de pcr quantitave, auquel je ne comprend pas grand chose.
je teste l'expression de certains gènes par rapport à un gène de ménage (16S).
première question est e possible de faire une comparaison sachant que l'efficacité de la pcr n'est pas la m^me (100 % pour le 16S, et 75 % pour les autres gènes), et comment faire pour améliorer l'efficacité de ma pcr??
Merci
Déjà, es tu sur de ne pas faire plutôt de la RT-qPCR ?
C'est mieux pour étudier l'expression de gènes.
Pour améliorer l'efficacité, il faut jouer sur la pureté et la quantité de tes ADN (car on amplifie des ADNc, pas les ARN en quantitatif), les temps et température des différentes étapes, la concentration en MgCl2 et en amorces.
MErci pour la reponse,
oui, c'est bien une RT-qPCR,
est ce que je ne peux pas comparé mes rsultats si l'eficacité n'est pas à 100 %?
L'efficacité est assez rarement égale à 100%. Des tas de paramètres influent sur celui ci avec des relations complexes. Si tu connais ton efficacité, tu peux savoir combien d'ADNc on donné par la suite les amplicons, donc non ça me parait pas illogique. C'est le but de calculer cette efficacité, car pour ce qui est de la limite inférieure pour accepter la manip, c'est un peu flou. certains disent faut rejeter en dessous de 80, d'autres 90, et d'autres tant que y a des amplicons, c'est que c'est bon
Bonjour,
Pour répondre directement à ta question, je dirais que ton efficacité est trop faible.
Si tu utilises la méthode du delta Ct; si les efficacités des PCR ne sont pas identiques (ou au moins relativement proches), les pentes des droites (que tu génères en quantification absolue) ne seront pas parallèles, et tu vas introduire un biais dans tes calculs.
je pense que le mieux est d'essayer d'améliorer ton efficacité PCR (T annealing, Q primers, Q MgCl2...).
