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PCR quantitative



  1. #1
    malesore

    PCR quantitative

    Bonjour à tous !


    Je me posais une petite question quant à la PCR quantitative.

    J'aurais voulu savoir si la quantité d'ADNc de la matrice pouvait jouer un rôle dans l'efficacité de la PCR-Q surtout pour des fortes concentrations.

    Es ce qu'il existe une limite supérieure en ADNc ou en ARN (si on fait du one step) pour réaliser une Q-PCR correcte ?

    Merci de vos réponses.


    A plus

    -----

    Seul l'étang calme reflète les étoiles

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  3. #2
    Tefnout

    Re : PCR quantitative

    Salut malesore

    La réponse est oui !

    En ce qui me concerne, je quantifie de l'ARN viral du VHC par RT-PCR quantitative et on voit clairement des inhibitions pour des concentrations en ARN trop importantes.
    Sont-elles dues aux ARN en eux-même, ou à des cochonneries dans la prep ? je ne sais pas.


    Un labo voisin a eu également ce genre de problème et c'était d'autant plus problématique que la RT-PCR servait à détecter une éventuelle séropositivité.

    Plusieurs fois, en réalisant des triplicate à la même concentration d'ARN de départ, les échantillon d'un patient réellement infecté se sont révélés négatifs ! En refaisant la manip en triplicate, mais avec 3 dilutions différentes, le patient à bien été détecté positif.


    Dans mon cas, j'utilise des dilutions au 10e, 30e et 90e. Ce qui revient à faire les quantif sur environ 50, 17 et 5 ng d'ARN totaux. Et là, en tenant compte de la dilution bien sur, j'obtiens 3 fois le même nombre de copies.
    Alors que si je ne dilue pas, mon nombre de copies est plus bas ! parfois beaucoup plus bas...

    Si tu veux plus de détails, n'hésites pas !

  4. #3
    malesore

    Re : PCR quantitative

    Très intéressant ma foi, ces résultats m'intéressent beaucoup.

    Moi je pars de 100 ng d'ARN et ensuite mes produits RT qui sont récupérés dans 20 ul je les dilue 5 fois pour être bien ...


    Mais là j'ai un collègue qui aimerait partir de plus d'ARN au départ, mais voilà je me suis posé la question jusqu'à quelle quantité on peut être sur des résultats ...


    Si tu as d'autres infos je suis preneur ..


    Tu fais du one step ou du two step ? Ta RT tu l'a fais avec quel kit et avec quel volume ?


    Merci en tout cas
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  5. #4
    IngDr

    Re : PCR quantitative

    Autre renseignement important, le type de primer utilisé pour la RT : random, oligodT, ou oligo spécifique. Car là réside souvent la solution.
    Par ex, si tu as un gène tres faiblement exprimé, donc peu représenté dans tes ARNm, si tu prends une quantité d'ARNm suffisante pour que ton transcrit soit présent, avec un oligo dT il sera amplifié, et en random aussi. En spécifique, de toute facon, et il n'y aura que lui. Par contre, si tu prends "trop" d'ARNm, en random et oligodT, ce seront principalement les autres transcrits, nettement plus abondant qui seront réverse transcrit. Donc, dans les mêmes conditions de RT (quantité d'enzyme, temps, quantité de primer, de dNTP), si tu as trop d'ARNm, et que ton transcrit s'exprime peu, il risque de ne pas être reverse transcrit, sauf si tu utilises un oligo spécifique pour la RT.
    D'où l'intérêt de toujours faire une gamme standard, pour s'assurer que les CT du dosage obtenu se trouve bien dans la zone de réponse linéaire (dans les mini, et les maxi, ce n'est jamais linéaire).

    Ensuite, un autre problème peut aussi venir du type de detection : si tu utilises du SYBR green, celui ci va se fixer sur tout ce qui est double brin, et donc fluorescer. Ce que j'ai vu, du moins sur ADN génomique, c'est que plus on mets d'ADN au départ, plus le seuil de fluorescence de base est élevée. Donc, on peut se poser la question de savoir si la quantif va se faire aussi bien dans cet echantillon, car le niveau de base est plus fort, donc le début de la phase d'amplification exponentiel sera masquée par ce bruit de fond.
    La encore, si tu as une gamme suffisement large, tu peux t'en sortir, et voir quelles concentrations/quantités utiliser.

    Cordialement,

  6. #5
    malesore

    Re : PCR quantitative

    Merci pour ces infos IngDr !
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Tefnout

    Re : PCR quantitative

    Merci IngDr c'est vrai que de nombreux paramètres entrent en compte !

    Pour te répondre Malesore, voilà ce que j'utilise :
    Je fais des extraction d'ARN total avec un réactif type tryzol.
    Au final, j'ai de l'ordre de 100 ng/mL d'ARN (dans 30 µL d'eau traitée DEPC)
    Je fais une RT-PCRq one tube marque BIORAD avec SYBR Green (si tu veux la ref précise je te dis ça demain matin) sur un appareil BIORAD. (Un labo voisin utilise un appareil et des réactifs Roche donc si ce cas de figure t'intéresse je peux transmettre tes questions).
    J'utilise des amorces spécifiques. Ma réaction se fait dans un volume final de 25 µL (5 µL d'ARN dilué et 20µL de mix).
    A chaque manip, je refais toujours une gamme standard car j'ai déjà vu des variations de 2 à 3 Ct parce que la machine commençait à merdouiller au niveau de la lecture de la fluorescence, donc toujours une gamme, toujours...
    Dans mon cas, la gamme va de 5.10^7 à 5.10^3 copies de virus. En dessous de 10^3 copies, ça sort n'importe comment, voir comme si c'était de l'eau additionnée de mix.
    D'ailleurs à ce propos je rebondis sur ce que disais IngDr : il est fréquent que mon témoin eau sorte à 30 cycles et plus. dans mon labo on explique ça part les fameux "dimers de primers"
    Bon, je ne sais pas quoi en penser, mes amorces ne sont pas sensées en théorie s'hybrider entre elle. Mais entre la théorie et la pratique... et puis il suffit peut être de quelques liaisons.
    Ca se voit très bien sur une courbe de fusion, là j'ai 2 pics bien distincts, celui des dimers, et celui de mon amplification. Et je choisis donc de faire la mesure de fluorescence dans une zone de température où les dimers seront dissociés.
    Bref en dessous de 10^3 copies, le pic de dimers prend le pas sur le reste.

    J'espère être assez claire...

    En tous cas je suis ravie de voir que je peux discuter RT PCR q ici car ce n'est pas une partie de plaisir. La manip en elle même n'est pas très difficile, même si elle demande bcp de soin. Mais les résultats sont parfois déroutants.

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  10. #7
    malesore

    Re : PCR quantitative

    d'accord moi aussi j'utilise biorad pour la RT avec de l'Iscript.

    et après je fais ma Q avec le mix de che Eurogentec c'est bien moi cher et tout aussi efficace que Biorad


    Merci pour toutes ces infos. On va essayé de regarder ca avec mon collègue pour sa manip.
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  11. #8
    Annaick_R

    Re : PCR quantitative

    Bonjour,

    je suis un peu surprise de la technique de la sélection de la température pour éviter les dimères d'amorces expliquée par Tefnout. Ca ne me parait pas très fiable.
    Quand j'avais un couple d'amorces qui me donnait 2 pics dans les conditions "classiques", je l'éliminais d'office. Il faut dire que je travaillais dans le contexte d'une famille multigénique dans laquelle certains gènes étaient quasiment identiques. Je ne pouvais donc pas savoir si le 2e pic correspondait à un dimère d'amorces ou à la détection d'un autre gène (je travaillais en SYBR Green).
    Dans d'autre cas, il pourrait s'agir de la détection d'une 2e espèce ou sous-espèce de virus ou de bactérie. Donc attention aux dimères !
    J'utilisais les programmes oligo 4 (Applied Biosystems) et Amplify pour tester la spécificité de mes paires d'amorces.

    Pour revenir à la question initiale de malesore, oui trop de matrice inhibe l'efficacité de la PCR.
    J'ai obtenu une gamme linéaire avec des dilutions d'ADN génomique d'Arabidopsis thaliana entre : 40 ng (max) et 10 pg (min). Au-delà de ces valeurs, la PCR n'était plus reproductible.
    Si un gène est très faiblement représenté, il est possible d'augmenter le nombre de cycles.
    Ceci dit j'arrivais à détecter des expressions très faibles avec mes PCR de 40 cycles (sur GeneAmp 5700). La plus faible a été 23 copies/ng ARN total.

    Annaick

  12. #9
    IngDr

    Re : PCR quantitative

    L'augmentation de la température au moment de la prise de fluorescence est une manière d'éliminer la fluorescence due au dimer de primer. On trouve cette technique dans les recommandations technique du lightcycler il me semble. Perso sur mes couples avec dimer de primer, des fois ca marchait, et des fois pas, ou plutot, quand j'augmentais le t° au dela du Tm des primers pour la prise de fluorescence, il arrivait que mes primers n'amplifient plus avec une bonne efficacité, alors qu'à température plus basse cela allait !

    Pour Tefnou, concernant les dimers dans le tube sans ADN, ce n'est pas un problème, si tu ne retrouves pas le pic dans les tubes avec ADN. Dans ton tube controle, il n'y a que tes primers, et pas d'ADN, donc des fois ils vont quand meme réussir à s'hybrider. Il m'est même arrivé que des primers fassent des dimers dans l'eau, pas dans mes échantillons test, sauf dans ceux où l'expression du gène était faible ==> pas assez de matrice, ils préféraient s'hybrider entre eux !

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