purification d'épisome et CsCl gradient

[invite2ac96057]

bonjour tout le monde,

je travaille sur un parasite qui génère des épisomes naturellement.
Afin d'étudier la fonction de ces épisomes j'aimerai les isoler pour pouvoir les modifier et ainsi transfecter des cellules qui n'en ont pas pour voir ce que ça fait!
Afin de pouvoir faire cette étape de clonage de mes petits épisomes chéris j'ai besoin de beaucoup d'ADN et d'après plusieurs personnes la seule façon d'avoir assez d'ADN extrachromosique serait de faire un gradient de césium.
Alors voilà, je n'en ai jamais fait, j'ai déjà lutté pour trouver une ultracentrifugeuse, et dans les articles ça parait tellement simple!!!
Est ce que quelqu'un aurait de l'expérience en gradient de Césium ou alors une publie où c'est assez bien détailler ou encore un protocole à me proposer???

merci d'avance,

xxx Franck
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[invitee4e79868]

Bonjour,

Oui, les gradients de Césium... A la fois très simple et très compliqué.
J'ai du en faire (des doubles) afin de purifier des particules virales.
Donc, c'est très simple à faire, car cela ne demande que du chlorure de Cesium ultra-pure comme réactif.
Il te faudra également une ultracentrifugeuse (qui peut fonctionné sur la nuit), un collecteur de fraction et d'un lecteur d'indice de refraction. Ainsi qu'une PSM, pour travailler proprement.
L'étape où ca se corse, c'est le choix des paramètres. En effet, pour une purification "parfaite", il faut avoir une idée très précise de la densité de ton épisome. Enfin, il est possible d'y aller à taton, mais cela prends du temps...

Pour faire simple, premièrement, il faut lyser l'échantillon et enlever tout les débris (centrigugation rapide), puis, dans un boudin de centrifugation, tu déposes la phase "lourde" de Césium, puis par dessus, la phase "légère" (par exemple, 1.4 et 1.3 respectivement), et enfin l'échantillon. Le tout très délicatement, pour ne pas mélanger les phases entre elle. Vient ensuite une étape d'ultracentrugation (généralement 16h à vitesse max -10%). Il faut ensuite délicatement récolter des fractions (de quelques centaines de microlitres) avec le collecteur. Tu regardes ensuite l'indice de refraction de chaque fraction, et tu pourras en déduire où se trouve tes épisomes. Tu peux ensuite confirmer leur présence et leur quantité en réalisant un Dot-Blot.
Enfin, si tu veux de l'ultra-pure, tu peux réaliser un second gradient, en utilisant les fractions que tu as récupéré et choisit à l'étape précédente. pour cela, tu mixes tes fractions, calcul l'indice de refraction (et donc la densité en Césium), et finalement calcul qu'elle sera la densité idéale pour la phase lourde de Césium (par exemple, une phase légère avec echantillon à 1.36, et une phase lourde sans échantillon à 1.38). Puis relancé l'ultra, re-mesurer les indices de refraction, vérifier la présence d'épisomes.
Bref, beaucoup de boulot
Petite indication : le Césium est par super bon pour des cellules ou des organismes. Il faut donc généralement inclure une étape de dialyse, afin d'en enlever un maximum.

Ci dessous un lien sur la purification de particules d'AAV pour usage médicale par gradient de césium. Cela te donnera une idée plus claire! Attention, c'est du Nature, donc payant si tu ne fais pas partie d'une universitée ou institut de recherche.
http://www.nature.com/mt/journal/v11...t2005252a.html

[noir_ecaille]

Pour le gradient au césium et sa mécanique : voir ce fil et la vidéo (très pédagogique)

http://forums.futura-sciences.com/ch...e-densite.html

L'ADN quelle que soit la taille de la séquence "surnagera" à la même hauteur du culot.

C'est réellement simple, fallait juste y penser ^^


Par contre il faudra peut-être réaliser d'abord une extraction ADN par CsCl, puis une électrophorèse sans digestion pour récupérer les épisomes -- censément parmi les nucléotides intermédiaires entre les ARN de tout poil et les chromosomes. Ou alors une purif sur colonne à billes si on connait la taille approximtive des épisomes -- on choisira le gel en conséquence.


Bonne chance pour la suite

[invite2ac96057]

Merci à tous les deux...
même si maintenant je passe par une phase de découragement aigu... Je connaissais la théorie mais je n'ai jamais eu à en faire.
Quand j'ai posé la question à l'expert dans le domaine je redoutais cette réponse et quand je vois tout ça j'ai bien eu raison d'avoir peur lol

Cependant je me pose toujours une question à propos de billes mentionnées par noir_ecaille, je connais la taille de mes épisomes, entre 14 et 18 kb, mais ces billes sont des billes de sépharose? J'avoue que là je voyage dans des terres inconnues (mais il n'y a pas Frédéric Lopez) que se soit pour moi ou pour les gens de mon équipe!!!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee4e79868]

Pas besoin de te décourager, ce n'est pas si dur que cela (même si c'est toujours dur d'appliquer un nouveau protocole, faut bien prendre les marques).
La technique de noir_ecaille à l'air comme même plus simple que la mienne. Je ne pense pas que tu ai besoin d'une purification de 99,99% (ce que offre un double gradient de césium). Du coups, une colonne ou des billes pour purifier ton ADN est un choix judicieux, suivit d'une purification sur gel. La meilleur solution est la plus simple!

Voici une idée : tu as ta taille approximative de tes épisomes, tu choisis donc une colonne qui "capture" cette taille d'ADN (et ARN, malheureusement) aux alentour de 10-20kpb. Après cette première purification (tu as enlevé protéines/lipides), tu peux ajouter quelques unités de RNAseA pour digérer tout les ARN (normalement, tu t'en fous, de ces ARN). Tu enchaines ensuite sur une migration sur gel (pas de digestion comme le fis noir_ecaille) d'agarose 0.8% (plus ou moins, c'est à toi de voir). Et tu essayes de voir si tu as des bandes qui se dégagent aux alentour de 14-18kb. Si tu es chanceux, tu n'en a qu'une (n'espère pas trop!) => c'est ton épisome; Tu en auras probablement plusieurs, tu coupes chaque bande, puis tu les purifies (il y a des kit spéciaux pour cela, qui coute pas cher), et tu fais séquencer. Tout ceux qui s'aligne sur de l'humain (ou l'ADN de la cellule hote) => poubelle. Les autres, il te faut une analyse plus précise (tu dois avoir une idée des gènes dans ton parasite...).

Une purification (double) au CsCl permet un résultat beaucoup plus pure et précis. Dans mon ancien laboratoire, nous étions capable de différencier les capsides pleines et vides de notre virus juste avec l'indice de densité obtenu, voir les différentes isoformes de la capside... Mais tu n'as pas besoin de cette résolution... Encore une fois, la solution la plus simple est généralement la meilleur!

[invite2ac96057]

OK Je vois maintenant.
Une fois j'ai purifier des plasmids que j'avais transfecté dans mes parasites en utilisant le kit de miniprep de Macherey-Nagel.
L'avantage avec ces plasmids c'est qu'ils contenaient un marqueur de sélection, donc j'ai pu les amplifier dans le parasite avant de les extraire, et qu'ils possédait aussi la b-lactamase ce qui m'a permit des les retrouver en transformant des bactéries. Mais là avec les épisomes naturels je ne peux pas transformer des bactéries avant d'avoir modifier mes épisomes. Je ne sais pas si j'aurai assez d'épisome par cette technique.
Je pense que je vais tout tester et on verra laquelle me donnera le plus d'épisome.
Merci encore pour le temps que vous avez passé tous les 2 à me répondre.
cordialement,
Franck