Carte de restriction d'un plasmide inconnu

[invite1226a3a4]

Bonjour,
Je me permets de vous écrire car j'ai un TP de cancérologie ou nous devons réaliser une carte de restriction d'un plasmide inconnu et on doit se débrouiller. On a a notre disposition les enzymes : Aat II, BamH1, BglII, Eco RI, Eco RV, Hind III, Pst I, Pvu II, Sac I, Sma I, Stu I, Sba I et Xho I. Sachant que l'on doit choisir 5 à 6 enzymes. Deja dans un premier temps comment peut on savoir lesquels choisir préférentiellement? Est ce que le choix des enzymes auraient juste avoir avec les couples d'enzymes qui ont une bonne activité ensemble pour pouvoir les coupler lors des digestion avec un même tampon? Je compte faire mes digestions et analyser sur gel d’électrophorèse d'agarose à 1% (ne connaissant pas du tout la taille du plasmide je suppose qu'il a plus de chance de se trouver entre 10kb et 0.5 qui me semble être le standard non? qu'en pensez vous?)
Ensuite pour mes digestion :
numero 1 : marqueur
numero 2 : plasmide non digéré
numero 3 : plasmide + enzyme 1
numero 4 : plasmide + enzyme 2
numero 5 : plasmide + enzyme 3
numero 6 : plasmide + enzyme 1 + enzyme 2
numero 7 : plasmide + enzyme 1 + enzyme 3
numero 8 : plasmide + enzyme 1 + enzyme 4
numero 9 : plasmide + enzyme 1 + enzyme 5
numero 10 : plasmide + enzyme 1 + enzyme 6
numero 11 : plasmide + enzyme 2 + enzyme 3
etc ... jusqu'a enzyme 6
Je ne sais pas trop comment supprimer des "puits" pour depenser le moins de gel et d'echantillon. Aurez vous un conseil de méthodologie a me suggérer? doit on faire toutes les enzymes une par une obligatoirement? etc... Ou bien doit on faire 2 gels et adapter suivant ce que l'on trouve au premier jet?
Je vous remercie d'avance pour votre aide
Cordialement
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[invite1226a3a4]

ou bien un gel à 1.2% pour un ADN linéaire allant de 7Kb à 0.4?

[invitee4e79868]

Bonjour,

Tu ne peux faire q'un gel? Tu as combien de temps? C'est pour savoir si tu peux faire plusieurs "run"...
Ensuite, il n'est pas possible de mélanger toute les enzymes. Soyons fou, et admettons que tu veuille mettre ton plasmide et tes 6 enzymes en même temps. Tu va devoir choisir un tampon de digestion (ph, concentration en sel) unique pour toute tes enzymes. et certaines ne fonctionneront alors pas (enfin, il est possible une astuce, mais pas avec un choix restreint d'Ez). Le deuxième problème est la concentration en glycerol. Généralement, les enzymes sont suspendu dans un tampon coupé à 50% de glycerol, afin d'éviter les cycles de congélation/décongélation, qui abimeraient l'enzyme. Cependant, le glycerol est très mauvais pour l'activité de l'enzyme, et communément, ont admet que la quantité d'enzyme (+glycérol) ne dois pas dépasser 10% du volume total de digestion.
Si je me souviens bien, un excès de glycérol conduit à une activité "étoile" de l'enzyme, c'est à dire coupure aléatoire.
Ceci devrait te permettre de réduire le choix de tes enzymes et le nombre de puits. Après, faut éviter de choisir des enzymes dont le site de restriction est trop semblable. J'entends par là qu'il y a des enzymes qui reconnaissent le même site palindromique, mais ne le coupe pas de la même façon.
Un gel de 1.2 me semble plus adapté, comme le dit la-science-pas-infuse.

Enfin, je conseillerai de faire cette analyse en deux étapes. La première digestion/migration avec des enzymes seules (+plasmides ), les 6. Puis tu t'arrêtes, tu regardes le profil de digestion, et tu relance une digestion avec des doubles (ou triple, si possible) digestion. De cette manière, la première étape t'évite de lancer des digestions avec des enzymes qui n'ont pas de site de coupure dans ton plasmide.

[invite1226a3a4]

Merci beaucoup pour ta réponse! On a 4 jours en fait et on doit se gérer comme bon nous semble sachant que l'on a d'autres expériences sur le feu si je puis dire! Je n'ai aucune idée de si j'ai le droit de faire 2 gels car a la base je pensais à la meme chose que toi! J'en saurais plus Lundi je pense! je vais regarder ça alors! Merci beaucoup en tout cas

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite2ac96057]

Moi j'ai jeté un coup d'oeil à tes enzymes, car je m'y prendrais exactement de la même façon que biseibutsu.
Quand tu parles de SbaI tu veux certainement parler de XbaI. Alors là je t'avertis que tu peux rencontrer des problèmes avec cette enzyme.
Elle ne coupe pas quand il y a méthylation et donc si tu ADN est très méthyler tu peux avoir des problèmes de coupure. Quand on l'utilise pour le clonage dans des bactéries ont utilise des bactéries dites dam- qui ne méthylent pas!
bon courage
Franck