transfection

[invite643e4f0b]

Bonjour tout le monde ,
voilà j'explique mon soucis, j'ai crée des bactéries contenant des constructions plasmidiques , j'ai fait des minipreps pour faire le sequençage , et congelé le reste pour stocker dans du glycerol à 75%
le séquençage étant bon , je pouvais à présent transfecter mes cellules , et donc j'ai préparé des midipreps pour transfecter et là je découvre que je n'ai rien , mon stockage devait être mauvais ou pour une autre raison que j'ignore , mes bactéries ne servaient plus à rien , tout ce que j'avais c'était mes minipreps de départ , alors j'ai lancé ma transfection avec mes minipreps , sachant que le protocol d'extraction des mini differe de celui des midi je ne sais pas ce que ça va donner ?? y en a t il parmis vous qui s'y connaissent ??
merci par avance
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[invitee4e79868]

Tout dépends comment tu purifies tes mini et tes midi.
Classiquement, les mini sont purifiés à l'aide de billes, qui vont retenir les charges négatives de l'ADN plasmidique. Cependant, cette purification est loin d'être parfaite, et il restera probablement des protéines, dont du LPS (à petite dos, ça va pour les cellules, à haute, cela induit un stress => pas top). De plus, le plasmide n'est généralement pas très concentré; enfin, tu peux vérifier tout ces paramètres en dosant au nanodrop (ou lecture de l'absorbance dans l'UV et proche UV) avec le rapport 260/280 (protéine/ADN).
Les midipreps se font presque exclusiment avec des colonnes de silice chargé. C'est beaucoup plus propre à l'arrivé, et bien sur plus concentré.

D'ailleurs, au laboratoire, pour garder des bactéries une poignée de jour (moins de une semaine), on ne les congelais généralement pas, 4°C, c'est suffisant, avec le buchon bien fermé.

En fait, tu as déjà du vérifier, mais tu n'aurais pas oublié de rajouter l'antibiotique pour garder la pression de sélection sur tes bactéries? Cela arrive à tous le monde (ou de se tromper d'ATB )

[invite643e4f0b]

merci pour ta réponse , à vrai dire j'ai fait mes mini preps avec un kit de roche , tout comme mes midi d'ailleurs , à priori je n'ai pas oublié l'ampicilline j'ai repeté la purification 3 fois ( 2 midi et une mini)
en transfectant avec les mini j'ai pris soin d'utiliser la bonne quantité d'ADN ( nanodrop) , donc si je comprends bien, la transfection à avec des mini n'est pas impossible ??

[invitee4e79868]

Pas impossible. Mais déconseillé. Enfin, faut tester pour savoir
Pas contre, faut pas s'attendre à publier les résultats, hein! Cela ne pourra être que des résultats préliminaires, pour se donner une idée, avant de les valider avec de l'ADN bien pure.

[A voir en vidéo sur Futura]

[noir_ecaille]

Question de pure curiosité... Quoi être minipreps et midipreps ? Des liens peut-être ?

[invitee4e79868]

En fait, on peut parler de prep... Cela va de la micro à la giga (ou plus peut-être). En fait, c'est juste pour donner une idée de la quantité d'ADN que l'on souhaite récupérer. A ce jour, les micro n'existe plus, on réalise à la place une PCR sur colonie ou demi-colonie (plus rapide).
Une miniprep, c'est récolté entre 100ng à 5µg d'ADN "purifié", vu qu'il s'agit généralement d'une purification par bille. Enfin, les dernières colonnes peuvent comme même donner des résultats propres. C'est généralement réalisé avec une culture de 2mL. On utilise généralement ces ADN pour le séquencage, screening, digestion...
Les autres (midi, méga, giga) sont purifiées à l'aide de colonne de silice (par affinité). Généralement très propre. une giga bien faite peut permettre d'obtenir jusqu'à 15 milligramme d'ADN purifié. En partant de 1L de culture ou plus! (nous le faisions avec 2L, au laboratoire). C'est le gros stock pour les grosses manips (production de protéines, virus, grosse transfection...)

Comme lien, ce sont les sites de vendeurs les plus informatifs
miniprep (impossible de retrouver la référecence des billes - bien moins cher!)
http://www.qiagen.com/Products/Catal...inginformation
gigaprep
http://www.sigmaaldrich.com/life-sci...aprep-kit.html

[invite2ac96057]

Ma question est sur le Glycérol, tu utilises du Glycérol 75% mais qu'elle est ta concentration finale en glycérol?
Le Glycérol c'est pas le top pour les cellules en général. Quand je congèle mes bactéries après miniprep la concentration finale en Glycérol est de 10% et je n'ai jamais eu aucun problème pour les faire repartir même en grattant un peu pour une midiprep de 200ml

[invitee4e79868]

Nous utilisions du glycerol pure et stérile (99%), pour une concentration finale de 25% (jusqu'à 50% pour les bactéries "fragile", c'est à dire avec un grand plasmide (entre 15 et 20kpb).
Tu peux essayer de faire une préculture, tu gratouille le matos avec ton cone, puis tu le plonge dans 2mL de LB ou Terrific (c'est plus riche, le Terrific) sur la journée, et le soir, tu propulses le tout dans 250mL de milieu frais. Mais tu fais peut-être déjà comme cela.