Bonjour tout le monde,
Je cherche actuellement à induire l'apoptose de 3T3 swiss albino pour effectuer le contrôle positif d'une manip de cytométrie (autre que la staurosporine, trop chère pour le labo...). Quelqu"un aurait-il une idée?
J'ai pensé au DMSO, au Dexamethasone ou la camptothécine mais ne sais pas si ça marcherait et si oui à quelel concentration / temps d'incubation...
Merci d'avance!
La staurosporine ne coute pas cher... Vous ne pouvez pas vous faire dépanner ?
Sinon il y la H2O2...
La dexamethasone ca marche bien sur certaines cellules mais jamais testé sur des 3T3 (c'est des fibroblastes il me semble?), enfin cherche la biblio tu trouveras sans doute qqchose.
Si tu cherches pas un controle où les cellules sont spécifiquement apoptotiques et que tu veux juste un signal positif pour tes marqueurs de mort cellulaire (par ex si tu fais un marquage classique annexin V/PI) tu peux aussi congeler/décongeler un aliquot de cellules ca te fera des cellules nécrotiques.
Notre labo commence tout juste son activité de culture cellulaire, on espérait trouver moins cher dans un premier temps..
Savez-vous à quelle concentration et pendant combien de temps il faudrait traiter les cellules avec l'eau oxygénée?
Oui, les 3T3 sont des fibroblastes, et je ne trouve pas grand chose dans la littérature (je ne suis peut-être pas très douée pour la biblio). C'est effectivement pour un marquage annexin V/PI, mais il me semblait que pour le contrôle Annexin V il fallait des cellules spécifiquement apoptotiques
Non les cellules nécrotiques seront AnnV+ aussi. En gros, AnnV+PIneg=apoptotiques et AnnV+PI+=nécrotiques.
Merci beaucoup pour l'info!
Encore juste une question: il se trouve qu'on ne dispose que de 2 cryotubes de cellules, et qu'on n'aura pas les moyens d'en congeler avant de commencer les manips (planning très serré et pas encore de congélateur -80°C), donc il sera difficile de sacrifier un de nos tubes pour faire le contrôle positif de la manip.
Est-ce qu'on peut retrouver ce résultat soit en laissant les cellules plusieurs jours dans très peu de milieu et sans le changer, ou en mettant nos cellules dans du milieu de congélation sans les congeler? (si oui, après combien de temps environ?)
Encoer merci d'avance
L'oxyde nitrique serait un inducteur d'apoptose vraie.
Il y a aussi l'hypoxie, ou encore la chaleur histoire de simuler des conditions fébriles. Peut-être une suite de chaud-froid de grande amplitude (20°C ?) alternés par cycle de deux heures en saturant le tube de CO2 ? En principe le stress les obligerait en plus à puiser sur leurs réserves aussi, ce qui accentuerait la starvation. Des UV et un peu de NaCl par-dessus, et on aurait presque une insolation cellulaire
Le but est d'avoir un contrôle positif pour quel paramètre ?
De toute facon tu vas pas bosser sur les cellules directement après leur reconstitution depuis les cryotubes non? Essaie d'être plus précis sur le matériel que t'as, et réponds à la question du dessus égalementJe connais pas trop cette lignée mais à priori t'as moyen de l'amplifier suffisamment pour faire tous les tests que tu veux.
Et pas besoin d'un -80 pour faire un cycle de congélation/décongélation, un -20 suffit.
Merci pour vos commentaires, voilà les réponses aux questions:
- je souhaite effectuer une manip de détection Annexine V / PI par cytométrie en flux. Je cherche donc à avoir un contrôle positif pour chacun de ces paramètres. Si j'ai bien compris, il me suffit d'avoir des cellules nécrotiques, ce que je cherche donc à obtenir.
- pour le matériel que j'ai, on commence tout juste l'activité de notre labo de culture cellulaire. J'ai deux cryotubes de 3T3 swiss albino commandées chez un fournisseur, dans une bonbonne d'azote liquide. J'ai un frigo et un congélateur à -20°C, et tout le matériel nécessaire à la culture des cellules. Je pensais donc les décongeler dans des flasques T25 et les passer ensuite dans des T75. Pour ma manip, je pense ensemencer des plaques 6 puits.
En contrôle positif d'apoptose/nécrose, je pensais tester un traitement à la camptothécine et un traitement avec un milieu acidifié à 5,5 pendant 2h. Qu'en pensez-vous?
Pour la congélation des cellules, il me semble qu'il faut un congélateur à -80°C, on ne peut pas les passer directement de -20 à -180, si?
Oui pour recongeler les cellules il te faudra un -80°C + l'accessoire nécessaire (boite de congélation type mr frosty).
Par contre t'es pas obligé de reconstituer tes deux tubes de cellules, en en reconstituant un seul et en amplifiant un peu la lignée tu devrais avoir de quoi faire toutes tes manips facilement, puis tu peux toujours garder une T75 de côté dans l'incubateur au cas ou tes premiers runs foirent.
Pour tes contrôles positifs, campthotecine ok, pour concentration/temps de traitement tu devrais facilement trouver ton bonheur en cherchant un peu, l'autre idée j'en ai jamais entendu parler. Mais c'est pas la peine de trop t'emmerder t'as pas besoin de douze contrôles + puis les kits annV/PI ca marche bien en général si tu fais pas de conneries
Super merci beaucoup!
Oui j'ai acheté une "Cool Cell" pour congeler les cellules, et je pensais n'en décongeler qu'un cryotube, j'ai fait tous les calculs et je pourrai lancer ma manip 1 semaine après décongélation
J'ai trouvé des données pour la camptothécine, à priori c'est 4µM pendant 4h (si ça peut servir à quelqu'un d'autre).
Pour l'autre méthode c'était un prototype fait maison, comme les cellules entrent naturellement en apoptose quand le pH du milieu est inférieur à 6.
Encore merci pour l'aide, je devrais m'en sortir maintenant!
