Mutagenèse par PCR : Tm des oligos

[invitee0f30148]

Bonjour,

En tp de génie génétique, nous avons fait une mutagenèse par PCR pour changer un nucléotide de la GFP pour qu'elle devienne bleu. On fait la mutation sur le plasmide pGLO.
Nous avons programmer le thermocycleur :
- Dénaturation à 95°C pendant 30 secondes
- Hybridation à 55°C pendant 30 secondes
- Elongation à 72°C pendant 7 minutes
Mais les Tm des oligos étaient de 79°C.
Nous devons mettre en relation les températures choisis avec le Tm des oligos mais je ne comprend pas pourquoi nous avons régler l'hybridation sur 55°C alors que les oligos ont un Tm de 79°C... Est ce que quelqu'un pourrait m'aider?
Je vous remercie par avance!
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[invite2ac96057]

salut,

c'est facile, tu fais une mutagénèse, tes primers ne doivent pas binder à 100% sur ta séquence. Je ne me souviens plus combien de nt il faut changer pour faire du BFP mais tu dois forcément laisser de la place à l'"erreur" que tu veux introduire. Donc tu réduits la température.
Même une PCR tu ne prends jamais le Tm. Classiquement tu prends Ta=Tm-5°C (quoique ça dépend des Taq) mais ton Ta ne doit pas être supérieur à 65°C donc si ton Tm est très élevé tu prends 65°C au maximum. Et si tu as des problèmes il est toujours conseillé de baisser la température, c'est moins spécifique mais tu as plus de chance d'avoir une bande. 55°C c'est la moyenne de Ta que tu peux faire (45°C<Ta<65°C) c'est juste qu'il te faut pour garder de la spécificité et pour introduire la mutation que tu veux sur ton 1er cycle. Après tes primers bind 100% sur les cycles d'après donc c'est parfait.

je crois que ne suis pas très claire sur le coup... Si oui je content sinon dis le j'essayerai de m'améliorer lol

franck

[invitee0f30148]

Je crois que j'ai compris : on diminue la température d'hybridation car la séquence de l'oligo n'est pas 100% appariée et donc si on veut qu'elle s'apparie il faut lui laisser du temps.

Encore une question puisque vous parliez de bandes : on a fait une migration sur gel pour voir si ça a marché et on avait pas de bandes (sauf celle des oligos) mais par contre les marqueurs de taille ont très bien migré! Ca ne veut pas forcement dire que notre PCR n'a pas marché non? Sinon pourquoi elle aurait pas marché? Erreurs de manipulation? plasmide incorrect?
Je précise que pendant ces tps nous avons utilisé pGLO et que dans toute les expériences où on l'a utilisé nous n'avions pas de résultats...

[invite2ac96057]

Normalement vous auriez dû avoir une belle bande d'ADN de haut poids moléculaire qui migre très mal.
Si il n'y a rien et que le marqueur à bien migré c'est un problème en effet.
Je ne dépose jamais sur gel, je transforme directement les bactéries avec mon produit de mutagénèse après digestion par DpnI, ça a toujours très bien fonctionner comme ça!
Etes vous certain que c'était bien du pGLO? une manip très simple pour savoir c'est de transformer des bactéries avec du pGLO, de les étaler sur boite de Pétri et ensuite de mettre la boite de Pétri au dessus d'un trans-illuminateur, les colonies devraient devenir vertes. Si ce n'est pas le cas c'est que le matériel de départ n'est pas de pGLO. On peut aussi faire un PCR ciblant le gène de la GFP encore plus simple de le digérer et de voir si c'est la bonne taille.
On peut toujours mettre en doute beaucoup de chose dans les TPs, les machines de PCRs des labos de TP universitaire ne sont souvent bien calibrées!!! N'ayant pas toutes les étapes du TPs c'est compliqué d'avoir une réflexion globale!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee0f30148]

Justement la suite du TP était une digestion par Dpn1 et après de transformer des bactéries avec ce produit de PCR : nous avons eu quelques colonies mais pas assez de temps pour les laisser grossir et pouvoir voir qu'elle étaient vertes ou bleues, et en plus on était pas équipé pour le voir! Le prof nous a donné un microtube tout prêt avec pGLO dedans donc on ne s'est pas posé de questions, on l'a mis dedans!

Merci beaucoup pour vos réponses en tout cas, j'ai eu quelques éléments à raconter dans mon compte rendu!