western blot, protéine phosphorylée et protéine totale?

[invite84b04748]

Bonjour à tous,

j'ai une question à vous poser les biologistes est ce que quelqu'un à la réponse à cela!

voici le lien de l'article sur lequel je travaille : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3382156/

dans la figure 9 A correspondant au paragraphe : ER stress induces intracellular Ca2+ levels after TMZ treatment.
dans le western blot y'a P-JNK et t-JNK ça correspond à la JNK totale et la JNK phosphorylée c'est bien ça? et phosphorylée c'est la forme active de la proteine c'est bien
ça?
En cherchant sur google j'ai trouvé que le t-JKN ça sert de controle interne, peut tu m'expliquer ce que cela veut dire? Et la GAPDH elle sert à quoi dans ce cas? et pourquoi avec d'autres proteines on isole pas la forme totale de la forme phosphorylée? Ou c'est par ce qu'il subissent d'autres modifications post traductionnelles autres que la
phosphorylation?
Une dernière question pourquoi on voit deux bande dans chaque ligne (2bandes pour la t-JNK et 2 bandes pour la p-JNK)? A quoi correspondent ces 2 bandes?

j'ai très besoin de votre aide
merci
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[invite2ac96057]

Premièrement la réponse à la 2ème question sinon ça ne veux rien dire.
JNK est un facteur de transcription qui a 2 isoformes une à 46 et une a 55kDa donc tu as 2 bandes.
Ensuite t-JNK signifie total-JNK, tu en as besoin pour déterminer une "quantité" de protéine phosphorylée. On ne peut pas vraiment dire que ce soit un contrôle interne. Si tu étudie la phosphorylation d'une protéine il te faut bien montrer quand tu fais une time course que l'a phosphorylation augmente sinon ça ne veut rien dire. Et tu dois aussi prouver que ce n'est pas parce que l'expression de la protéine diminue que tu vois plus de protéine phosphorylée... Donc tu es obligé de faire t-JNK (JNK phosphorylée + JNK non phosphorylée) et p-JNK. Et oui p-JNK est la bien la forme active.
Finalement GAPDH est lui un contrôle de charge, tu peux faire actine ou tubuline, c'est juste pour montrer que tu as loadé sur ton gel la même quantité de protéine. Ca sert à la normalisation.
J'avais oublié le cas des autres protéines... qui te dis qu'elles sont phosphorylées? Si elles ne le sont pas on ne peux pas montrer leur forme phosphorylée!!!

[invitea142fd95]

Bonjour,

Pour s'assurer d'une phosphorylation d'une protéine, une expérience de contrôle en présence de phosphatase doit être menée pour bien vérifier que la modif post-traductionnelle est une phosphorylation.