Décongélation et ensemencement 3T3

[inviteead763b0]

Bonjour à tous,

J'ai décongelé un cryotube de 3T3 Swiss Albino (fibroblastes de sourirs ayant perdu leur inhibition de contact) hier soir et ai ensemencé plusieurs T25.

Ce matin j'ai pu faire deux constats:
- un nombre important de cellules mortes flotte dans le milieu
- je n'ai pas bien ensemencé ma flasque, les cellules sont principalement concentrées en une zone, qui doit frôler les 90% de confluence, tandis que le reste de la flasque n'est pas très rempli.

D'où deux questions:
- à votre avis, vaut-il mieux que je change le milieu dès maintenant pour me débarrasser des cellules mortes ou j'attends demain pour ne pas les traumatiser dans leur croissance le lendemain de leur décongélation?
- dois-je rapidement passer les cellules pour que la partie de la flasque "surchargée" ne meurt pas (sachant que la lignée a perdu son inhibition de contact) ou vaut-il mieux les laisser pousser jusqu'à vendredi comme prévu?

Merci d'avance pour vos réponses!
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[invitee8e40fa4]

Bonjour,

normalement, le lendemain de la décongélation, les cellules encore en vie sont accrochées. Il faut d'ailleurs mieux culotter les cellules et les reprendre dans du milieu de culture avant l’ensemencement pour se débarrasser du DMSO (toxique). Après ensemencement, il faut faire une dizaine de 8 avec la boite pour bien répartir les cellules. Si les cellules sont immortalisées, il ne devrait pas y avoir trop de risque d'attendre vendredi mais, à ta place, je changerais le milieu aujourd'hui. Il est aussi possible de les passer aujourd'hui si les cellules vivantes sont assez nombreuses, elles repartiront mieux si elles sont bien ensemencées...

[Flyingbike]

moi je les laisserais jusqu'a demain puis je ferais un passage.
Idéalement il faudrait redécongeler et repartir d'un plating homogène.

[inviteead763b0]

Merci pour ces conseils.
C'est vrai que je ne les ai pas centrifugées après leur décongélation, le fournisseur ayant indiqué que ce n'était pas nécessaire, et que l'ajout de milieu frais permettait de neutraliser les effets cytotoxiques du DMSO. J'aimerais bien maintenir mon passage à vendredi, sinon ça décale tout le plan de manip prévu...

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

unifiedforces a raison a propos du DMSO, c'est toujours mieux de décongeler dans du milieu, centrifuger et resuspendre.

Si tu penses que tu as assez de cellules vivantes (je ne connais pas bien les 3T3) tu peux toujours te contenter de changer le milieu genre ce soir et les passer vendredi.

[inviteead763b0]

Merci beaucoup, je vais suivre vos conseils (et rectifier mon protocole de décongélation!), il me reste beaucoup de cellules vivantes.