Technique GST-Pull Down

[invite8d27bda6]

Bonjour,

Est-ce que quelqu'un saurait m'expliquer en quoi consiste cette technique ? Que sont des protéines de fusion ?
Merci d'avance
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[invitebba2dde3]

Bonjour,
cette technique permet de fusionner la GST avec une protéine d’intérêt pour par exemple étudier les partenaires protéiques,...
Pour cela on clone dans un plasmide l'ADN codant pour la GST et l'ADN codant pour la protéine d’intérêt, de cette sorte les deux protéines sont fusionnées (elles sont accrochées l'une à l'autres).

[invitee8e40fa4]

Bonjour,

le pulldown après c'est parce qu’on utilise des billes couplées à des anticorps qui fixent la GST et sa protéine fusionnée, on peut laver puis éluer pour concentrer la protéine d'intérêt...

[invite8d27bda6]

Ah donc si je comprend bien, cette technique permet de récuperer des protéines ? En gros on se sert de l'étiquette GST de la même manière qu'on se sert des billes pour l'immunoprécipitation ?
Merci en tout cas ^^

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee8e40fa4]

Bonjour,

c'est ça. Le truc c'est qu'il n'existe pas toujours d'anticorps dirigés contre les protéines d'intérêt ou d'anticorps bien spécifiques alors que ceux qui reconnaissent la GST le sont. Il existe aussi des techniques pour récupérer la protéine sans le tag à la fin, par exemple en clonant un site de restriction SapI entre le cDNA de la prot et celui de la GST. L'enzyme de restriction SapI coupe la séquence d'ADN SapI et une protéase (dont j'ai oublié le nom) coupe cette même séquence une fois traduite...

[invitea142fd95]

et une protéase (dont j'ai oublié le nom) coupe cette même séquence une fois traduite...

Bonsoir,

Pour la séparation de la GST fusionnée à la protéine d'intérêt, c'est peut-être à la digestion à la protéase de pré-scission (PSP (non pas la console ), au facteur Xa ou à la thrombine que tu fais référence ... ?
Une digestion à l'entérokinase peut se faire au niveau d'une séquence d'acides aminés DDDK/X.

[invitee8e40fa4]

Bonjour,

j'ai du utiliser ça il y a environ 8 ans dans une construction du genre TAG-SapI-cDNAprot-cDNAintein.

L'intein est capable d'une auto excision mediée par je ne sais plus quoi?

Il est vrai que les sites SapI n'apportent peut être pas tous les AA nécessaires au clivage mais que ça ne marche que si elle les apporte à côté d'autres AA présents de part et d'autre de son site d'insertion...

Enfin, il y a moyen de faire un truc du genre...