designer des primers pour séquençage de plasmides

[invite8feec808]

Bonjour,

Je dois designer des primers pour séquencer un plasmide. Mon insert fait ~2700 pb.
J'ai l'habitude de designer des primers pour qPCR, donc je me demande si c'est les mêmes caractéristiques.
la taille des primers par exemple (entre 18 et 25 nucleotides) et le Tm autour de 60°C est ce que c'est ok.
L'autre différence serait au niveau de l'espacement entre mes forward et reverse. de combien de pb doivent ils être séparé. Est ce que je dois couvrir la totalité de mon insert, dans ce cas je dois designer plusieurs couples de primers (3 par exemple?) est-ce qu'ils doivent être chevauchant ou pas forcément?

Merci de votre aide
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[Enialix]

Bonjour,

Des primers de qPCR peuvent très bien être utilisés pour du séquençage. Par contre il faut prévoir que la séquence ne commence pas directement après le primer, et que selon le type de séquençage et la qualité de ton plasmide, la longueur séquencée de manière certaine est assez variable.

Pour être vraiment tranquille, il faut que ton premier primer soit environ 150 pb avant ton insert, puis un primer toutes les 600-700 pb. Comme ça toutes les séquences que tu recevra se chevaucherons, et tu n'aura qu'a refaire le puzzle pour être certain de la séquence.

Enialix

[invite8feec808]

Merci de votre réponse,

150 pb avant l'insert, ceci implique de connaitre exactement le site d'insertion, information que je n'arrive pas à trouver pour le moment je n'ai que la séquence de l'insert donc je pense que je vais devoir designer mon primer au début de l'insert et si j'ai bien compris il faudrait que mes primers se chevauchent pour pouvoir entrecouper les séquences et avoir la séquence entière de mon insert

[Enialix]

Il faut en effet que les séquences se chevauchent.

Si tu ne connait pas le lieu d'insertion exact. Tu peux toujours séquencer en sens inverse le début de ton insert.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec0b62935]

Un primer de qpcr peut être utilisé pour le séquençage.

Si ton primer est en position 0, tu considères par ailleurs que ta séquence sera lisible entre +100 et +800 au minimum et sans doute entre +50 et +1100 (sauf rare cas d'insert particulièrement retors). Donc il en faudra au minimum 3 et sans doute 4.

[invite8feec808]

Ok, je vous remercie de vos réponses