Hybridation in Situ

[invite5806538a]

Bonjour,

J'ai un protocole d'hybridation in situ, et il y a quelques étapes que je ne comprend pas...
- la proteinase K permet de "faire de la place" pour les sondes, ou bien c'est pour dégrader les nucléases?
- à quoi sert le SSC (saline sodium citrate)? Si j'ai bien compris, c'est une solution tampon, mais juste après ça, j'ai une incubation de 30 minutes dans un tampon Tris/glycine, donc je ne comprend pas bien la différence entre les 2.
- pourquoi doit-on incuber à 55°C? Les sondes s'hybrident mieux?

Merci d'avance pour vos réponses!
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[invite02e16773]

Salut,

- La protéinase K sert à dégrader les protéines susceptibles liées à l'ARNm afin qu'il y ait une meilleure révélation.
- L'appariement plus ou moins spécifiques entre acides nucléiques (ici, entre la sonde et l'ARN) dépend de plusieurs conditions (pH, sels, température), le tout est appelé stringence. Le SSC permet de jouer sur la stringence (en jouant sur le pH / concentration en sels) qui ne doit pas être trop forte (laison trop difficile, manque de signal), ni trop faible (trop de liaison, signal aspécifique)
- Les sondes s'hybrident mieux et plus rapidement à température élevée (55, 60°C, ça dépend du protocole). Cf la relation entre température et stringence d'hybridation.
- La glycine, c'est pour bloquer la PK. Si le traitement à la PK est prolongé, le tissu peut se déteriorer et/ou le bruit de fond peut devenir énorme