hybridation in situ

[invite665784aa]

bonjour à tt le monde
je veux réaliser une hybridation in situ en utilisant des sondes marquées par cy3 et FAM sur des cellules d'amibes, je veux savoir est ce que la température (Tm) intervient dans la réaction d'hybridation?
Rq: Tm1= 57.56°c
Tm2= 61.94°c
si oui, dans un article publié dit que la température d'hybridation ne doit pas passer 52°c pour ne pas perdre le signal, que je doit faire? la réaction n'a pas marché, j'ai changé tout les paramètres sauf la T°, que je doit faire pour que la réaction marche?
merci
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[invite02cefc91]

Si tu calcules le Tm de ta sonde, ça donne quoi ?

[invite665784aa]

salut
Tm= (+/-) 59.75.(théorique)
j'ai un question:
est ce que je doit réaliser PCR avec ces sondes mais sans marquage avant de réaliser l'hybridation in situ pour obtenir Tm exacte d'hybridation?
merci

[Flyingbike]

peut être pas très utile puisque le Tm dépend des conditions salines et autres, il sera peut être différent dans des conditions d'hybridation in situ.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

et en général il faut placer la température d'hybridation un peu en dessous du Tm des sondes pour s'assurer une bonne hybridation, mais pas trop en dessous pour éviter l'hybridation non spécifique.

[invite665784aa]

je vais essayer et je vais voir le résultat
merci