Destruction des ponts disulfure

[invitee4e79868]

Bonjour à tous!

J'ai une bonne question de biochimie, qui aurait besoin d'une superbe réponse. Si elle existe, bien sur
Je cherche à détruire (ou oxyder) les ponts disulfure d'un mélange de protéine, et ce d'une façon que je puisse ensuite ajouter ma sonde fluorescente qui reconnait les thiols (extrémité S-H). Et pour compliquer les choses un peu plus, je ne peux pas avoir plus de 2 étapes, ne peut pas chauffer au delà de 50-60°C, et je préférerai que ma sonde fluorescente reste fluorescente. Oui, un vrai challenge
Pour ceux qui pensent au Beta-mercapto, DTT ou autre composés de ce genre, cela ne marche pas. Ma sonde fluorescente réagit avec eux avant même de réagir avec la protéine.
Je me demandais donc si vous connaissiez une méthode pour oxyder les ponts disulfures d'une protéine d'une telle façon que ma sonde puisse réagir ensuite avec les extrémités SH nouvellement créées?

Je rajoute pour info la sonde que j'utilise : AlexaFluor594 C5 maleimide de chez Invitrogen
Autre info : j'utilise également en parallèle une sonde succinimidyl 488 qui reconnait les résidues amines des protéines.

Merci de votre aide!
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[inviteb6144ea4]

Bonjour,

vous souhaitez réduire vos pont disulfures plutôt non?
Pourquoi ne pas utiliser le DTT dans une première étape, en effectuant ensuite un lavage (dialyse par exemple) pour éliminer le DTT excédentaire et n'ajouter qu'ensuite votre sonde lors d'une deuxième étape?
Si je m'en réfère au protocole du constructeur (protocole), ceci est parfaitement envisageable (en travaillant sans oxygène).

Bien cordialement

M.

[vpharmaco]

+1 avec Moumoutte
Si pour une raison x ou y, tu ne peux pas faire de dialyse, il existe des réducteurs non-nucléophiles, comme le TCEP, que tu peux utiliser http://en.wikipedia.org/wiki/TCEP

[invitee4e79868]

Merci à tout les deux.
Et oui, c'est réduire les ponts dissulfures. C'est mieux un bon langage (ce qui me fait défaut, parfois...)
Malheureusement, la dialyse est très difficile à mettre en oeuvre pour moi, vu que je travaille avec un volume de... 88pL (oui oui, picolitre!). Et que je ne veux pas diluer mon échantillon encore plus. Pour info, le volume de mon échantillon est d'environ 1pl, mais c'est juste une estimation!
Mais vpharmaco donne le produit qui à l'air de correspondre à mon besoin. Comme quoi, il est toujours intéressant de demander de nouveaux avis!
おんとにあっりがとございます
Sur ce, je vais potasser les fiches techniques du TCEP. Encore merci!

[A voir en vidéo sur Futura]

[vpharmaco]

Pour completer: il n'est pas necessaire d'utiliser un large exces de TCEP (qui, s'il est trop concentré, va tout de meme faire des miseres au maleimide)
5-10 equivalents par rapport au nombre de ponts dissulfures à réduire est un bon point de départ.
La reaction de bioconjugaison doit se faire idéalement autour de pH 7,5-8. En dessous, l'addition du thiol sur le maleimide sera lente (La cinétique de réaction est fonction essentiellement de la quantité de thiolate RS^-). Au dessus, tu commenceras à observer l'hydrolyse du maléimide.

[invitee4e79868]

Oui, j'ai lu des articles là dessus, trop de TCEP réduit la quantité de maléimide qui va peut se fixer sur les ponts dissulfures. Ce qui serai tout simplement vraiment pas bon dans mon cas. Quand au pH, le tampon HEPES utilisé est de 7.8, pile ce qu'il faut
Je vais faire des tests de fixations du marqueur fluorescent à des protéines témoins (BSA & lysozyme) la semaine prochaine avec un microscope haute résolution. Je verrai ce que cela me donne avec et sans TCEP. Et je croise les doigts

[noir_ecaille]

おんとにあっりがとございます

C'est quel idiome/patois ?

[invitee4e79868]

@noir_ecaille : kansai-ben. Mes collègues sont entrain de bien se marrer à m'apprendre le japonais, et plus spécialement ce patois
En traduction, c'est : vraiment merci beaucoup et je le pense, le TCEP va probablement résoudre pas mal de problèmes!

[noir_ecaille]

済みません J'avais lu ^^ Seulement ce n'est pas la forme habituellement rencontrée dans des bouquin de cours en France