problème de marquage cytochimique

[invitee5843a79]

bonjours a tous, je vous expose mon problème.
je réalise des hybridation in situ avec des sondes ARNm (U-DIG) sur coupe de morceau d'éponges. je révèle le marquage avec des anticorps anti-DIG couplé a une phosphatase alcaline. la coloration se fait avec du NBT/BCIP.

le témoin actine doit marquer partout et de la même manière or voila le marquage suis un gradient de coloration allant du pôle basal de la coupe au pôle apical.

est-ce que vous avez déjà eu ce problème sur des manip du genre ??
-----

[Flyingbike]

le témoin actine doit marquer partout et de la même manière or voila le marquage suis un gradient de coloration allant du pôle basal de la coupe au pôle apical.

quand vous dites "doit", c'est par rapport a une réalité expérimentale, c'est à dire que c''est connu ? Ou bien est-ce une supposition ?

parce qu'il est très possible qu'un gène ubiquitaire comme l'actine ait un pattern d'expression non homogène, en lien avec la fonctionnalité des différentes zones du tissu étudié.


En dehors de cette hypothèse, si c'est un biais expérimental, on a peut être une perméabilisation, une température d'hybridation hétérogènes sur la coupe. Toutes les coupes sont orientées dans le même sens ?

[invitee5843a79]

alors, oui c'est un fait connu l'actine doit marquer partout et nous sert de témoin positif.

les coupes ne sont pas orientées dans le même sens et pourtant le gradient se fait dans le même sens (basal => apical).
la température ne peut pas être hétérogène dans une étuve spéciale pour hybridation.
j'ai beau revoir tout le protocole je ne sait pas d'où cela peut venir !

[invitee5843a79]

help please

[A voir en vidéo sur Futura]