Séparation lymphocytes/monocytes

[invite2798216c]

Bonsoir,
j'aimerai que vous éclaireriez ma lanterne sur quelque chose qui m'est vraiment très nécessaire.. alors voilà, je dois faire une extraction des ARNm à partir des lymphocytes, seulement pour arriver à avoir des lymphocytes je galère. nous n'avons pas le kit au labo alors je suis obligée de faire par les méthodes classiques. je récolte du sang sur un tube EDTA, ensuite en utilisant ficoll je récupère mes PBMC dans une boite de pétrie. étant donné que les monocytes adhèrent au nylon je peux facilement récupérer mes lymphocytes qui n'adhérent pas; seulement je dois laisser mes PBMC en culture pendant 24h. la question qui se pose: combien de volume de RPMI 1640 je dois mettre dans mon milieu, combien de SVF et quels sont les antibiotiques que je devrais rajouter et à quel quantité.... pleaaaaaaaaaaaaaaase help me!!
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[invite2798216c]

pleaaaaaaaaaaaaassssssseeeeeee eeeee apportez votre grain de sel c'est très urgent!!

[Flyingbike]

Ben cela dépend, très classiquement on utilise le milieu de culture avec 10% de sérum et 1% de Peniciline-Streptomycine, si toutefois votre stock est bien a 100X.


Pour la quantité, cela dépend de la boite, on compte 3mL pour ø60mm, 10mL pour ø100mm

[invite513ac0a6]

J'aurais dit comme au dessus par défaut. Je suis pas sur que ce soit la peine d'attendre 24h, les monocytes sont sensés adhérer rapidement au plastique, et plus t'attend plus le profil d'expression des ARNm pourra différer des cellules fraiches.

Cela dit ce genre de méthode c'est quand même pas mal dépassé et t'auras jamais une aussi bonne pureté et rapidité d'exécution qu'avec un tri au facs ou macs. Enfin bon si t'as pas le choix c'est mieux que rien

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite2798216c]

Merci bcp Flyingbike

[invite2798216c]

tu as raison, c des techniques révolues mais je n'ai pas trop le choix... merci comme même