Quelles sont les différentes étapes quand on travaille sur les microsattélites

[Pricilla]

Bonjour à tous;

Voilà je travaille sur les microsatéllites pour essayer de voir la diversité génétique au sein d'une population, seulement je ne sais pas du tout comment s'y prendre.

Etape1: extraction ADG génomique: fait
Etape 2: PCR avec les amorces appropriées: fait
Etape 3: migration sur gel: comment choisir la taille du poids moléculaire? comment lire les bandes?
Etape 4: définition de la taille des allèles: comment on fait????? Genmapper???
Etape 5: Calcul du polymorphisme??? Quel programme utliser?

Merci beaucoup, je suis paumée de chez paumée
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[biseibutsu]

Bonjour,

Normalement, on planifie sa manip' avant de la lancer...
L'étape trois découle de l'étape deux. Quelles sont les micro-satellites que tu as amplifiés? Est ce qu'il s'agit de séquence de 20pb, répétées de 20 à 50 fois? Ou de séquence de 5pb répétés 10-20 fois? Suivant la longueur du satellite et son nombre de répétition min-max, tu en déduis les marqueurs du poids moléculaire (généralement un marqueur tout les 1-0.1kb est adaptés, mais parfois il faut un 10-0.5kb). Pour lire les bandes, il faut mieux un appareil photos/caméra adapté à la lecture de bandes ADN (sous UV).
Après, pour les étapes 4-5, je ne sais pas, vu que je le faisais à la main (calcul de taile, du nombre de répétition et finalement du polymorphisme). J'aurais envie de le faire sur une feuille de calcul Excel, mais il y a probablement des logiciels spécialisés. Si quelqu'un en connais un...

[Pricilla]

OK merci pour ta réponse

J'ai des répétitions de ce genre (GT)14 et (ATGT)11...
Quelle est la formule pour calculer la taille des allèles?
J'ai trouvé cette formule pour calculer la taille de l'allèle en pb : Taille (en pb) =129 + (16)(N répétitions) + 32 et je ne comprends pas d'où elle vient.


Merci

[biseibutsu]

Comme je l'ai dit, je ne suis pas un grand spécialiste sur ce domaine...
La formule que tu donnes semblent déjà adaptée à un micro-satellite.
Je dirais : taille = (longueur des 2 amorces)+ (longueur de la répétition)x(nombre de répétitions)
Par exemple, si tes amorces ont chacune une longueur de 20pb, et que tu as une répétition de 3x de ton motif GT
Taille = 20x2+28x(nombre de répétitions, soit 3)
Taille = 124
Bien sur, plus le micro-satellite est complexe, plus le calcul l'est également.
Et dans cet exemple, je pars du principe que les amorces sont en contact direct avec la micro-satellite. Ce n'est pas toujours le cas, et il faut dans ce cas rajouter cette distance (c'est probablement de là d'où vient le 129...).

Mais je ne comprends pas super. Normalement, on cherche à connaitre le nombre de répétition (N répétition) car on peut déterminer la taille du fragment amplifier sur gel. Et en utilisant un outil informatique et un bon marqueur de taille, on peut être précis dans cette estimation!
Par exemple, le fragment que j'ai amplifié mesure environ 150pb :
N répétition = (taille total - taille amorces - non micro-satellite) / longueur de répétition
Donc N répétition = (150-(2x20)-0)/(14x2)
N répétition = 3.9
Arrondi à 4. On aurai donc 4 répétition du motif (GT)14 pour cet individu.

M'enfin, je le comprends comme ça, hein!

[A voir en vidéo sur Futura]

[Pricilla]

un très grand merci pour tes réponses, cela m'a vraiment aidé à y voir plus clair