[Biologie Moléculaire] Méthodes d'étude de l'ADN

[inviteced1cdb6]

Bonsoir!
Je suis en première année de médecine et je voudrais savoir si vous avez des documents ou des sites internet qui pourraient expliquer comment étudier et tirer des conclusions sur un Western Blot par exemple.
Merci
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[invitee4e79868]

Bonjour,

Voici la page du ncbi consacré à cette technique : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/

Après, le mieux, c'est d'avoir un exemple. Voici une image d'un de mes vieux WB, je pense qu'il montre un peu tout ce que l'on peut s'attendre :

Dans ce cas, j'ai utilisé un anticorps ciblant la protéine SC35, qui fait partie des protéines SR (possédant au moins un domaine de liaison à l'ARN ainsi que des répétitions arginine-sérine).
On voit sur le contrôle (des cellules Hela du laboratoire) une bande majoritaire détectée, qui a une taille d'environ 35kDa (le marqueur de taille n'est pas dans l'image ici), et qui correspond vraisemblablement à notre protéine. Mais on observe également une petite bande au dessous, et plusieurs bande au dessus (60-70kDa). Au labo, on en a déduit que l'anticorps reconnait faiblement d'autres protéines de la famille SR... Donc une non-spécificité à prendre en compte, même si le ratio protéine SC35/autres protéines SR donne SC35 largement gagnante (en voulant "arranger " les résultats, il est possible de ne faire apparaître que la protéine SC35, en contrôlant le temps d'exposition). Sur la seconde colonne, ce sont les protéines des cellules HelaAAVtCR-SC35GFP qui sont analysées. Ces cellules possède un virus AAV modifié et inactif (pour le moment) dans leur génome. De plus, une transfection stable a été réalisée pour ajouter la séquence codante (ADNc) de la protéine SC35GFP. Finalement, ces cellules doivent exprimé la protéine SC35 et la protéine SC35GFP (fluorescente, au cas où ). La GFP faisant 27kDa, la protéine SC35GFP doit donc faire environ 27+35=62kDa. Et l'on observe réellement une bande supplémentaire forte (car expression intense) et du même niveau environ que la protéine native, que l'on observe également à 35kDa.
Le but de cette était de vérifier la production de SC35GFP, et surtout vérifier son poids moléculaire ainsi que la quantité relative vis-à-vis de la protéine SC35 native. On a donc put en conclure que la protéine SC35 n'est pas trop sur-exprimé (2-3 fois plus dans les cellules SC35GFP+) et que cette sur-expression est stable dans le temps. Ajoutons à cela une IF, et on observe que la protéine SC35GFP à une distribution caractéristique des speckles, corps nucléaire où elle se trouve en majorité. On dispose donc d'une protéine fusion probablement fonctionnelle (vu que sa fonction est liée à sa localisation).

[inviteced1cdb6]

Merci beaucoup biseibutsu!! C'est parfait tes explications sont très claires j'ai bien compris