Construction plasmidique

[invite75d831ba]

Bonjour,

je voulais savoir si j'avais bien compris les protocoles de constructions plasmique, donc si j'ai bien compris :

Premièrement je digère un fragment d'ADN génomique avec les enzymes de restriction afin de récupérer le gène à intégrer.
En ce qui concerne mon plasmide, il doit contenir : Un Promoteur, une Origine de Réplication, et des gènes de résistance ou de levé d'auxotrophie selon l'organisme.
Ensuite je digère mon plasmique, j'insère mon gène avec ligase.
Et pour terminer je fais un criblage afin de voir quel sont les organismes qui ont bien intégré le plasmide.

N'hésiter pas à rajouter des précisions ou corriger mes erreurs !

Merci, Bonne journée.
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[invite537c5180]

Bonjour,
Tu récupère ton gène à intégrer dans ton plasmide en l´amplifiant par PCR, c´est ensuite que tu digére t´es amplifiants en utilisant les mêmes enzymes de restriction que tu utilise pour digérer ton plasmide.

[invite75d831ba]

Bonjour,
Tu récupère ton gène à intégrer dans ton plasmide en l´amplifiant par PCR, c´est ensuite que tu digére t´es amplifiants en utilisant les mêmes enzymes de restriction que tu utilise pour digérer ton plasmide.

D'accord merci bien ! Sinon le reste des étapes est bien?

[invitefb4af953]

Hello!

Oui dans un monde parfait le protocole pourrait se résumer à cela. Patience, persévérance et sang-froid sont de rigueur pour une construction plasmidique.

D'abord ton gene d'intérêt stocké dans ton plasmide doit être amplifié à fond. PCR biensur équipé de primer spécifique si possible issue d'une dilution 10pmol bien fraîche.

Ensuite digestion des amplifiats obtenues par des enzymes encadrant le gène, et correspondant à là où tu veux le mettre dans ton nouveau plasmide, afin de le récupérer. Par contre si par construction plasmidique tu entend, logiquement, construire un plasmide entier, alors là lors de l'amplification des parties géniques sur des plasmides de stockage, les primers que tu utilise doivent posséder une partie liant le template et une partie non liant appelée overlap , d'au moins 40bp.

Migration des fragments, purification.

Ensuite comme les parties on des overlap qui correspondent il suffit d'appliquer le protocol d'overlap extension PCR. Puis Gibson assembly pour les grands gragments.

Suite à cela, ne pas oublier de désaler le produit résultant de gibson assembly si tu fais la transformation bactérienne ensuite par électroporation. Donc maintenant transformation de tes produits dans des bactérie compétente. Puis culture. Puis miniprep. Puis digestion pour voir si ta les bons plasmides dedans, puis t'envoi donc les bon clones au séquençage. Et si c'est bon c'est cool, sinon bon courage ^^

Evidement toujours controle après chaque PCR que tu a le bon produit avant de faire la suite.
Si les PCR marchent pas, joue sur le programme (température d'annealing généralement, regarde si les primers forme pas des hairpin).

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite75d831ba]

Merci bien, votre réponse va je pense au delà de mon cour mais c'est toujours ça !
Mon cour traite en fait des différents plasmides, et des éléments qui le compose ( promoteur fort ou non, adn polymérase, gène de resistance etc...) ainsi que les transformation génétique chez les levures et bactéries...
Mais la plupart de nos exercices sont sur les constructions de plasmide.