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L'ADN plasmidique



  1. #1
    selmabio

    L'ADN plasmidique

    Salut,afin d'extraire l'ADN PLASMIDIQUE un groupe de travail a inoculé 5ml de bouillon LB à partir d'une colonie isolée sur milieu gélosé ils ont incubé ce bouillon une nuit à37°C.

    si vous pouvez m'aidé de connaître pourquoi ils ont incubé une nuit et à 37°C?
    après ils ont centrifugé 1ml de culture pendant 2 minutes à vitesse maximale ,resuspendre le culot dans 1ml de tampon B puis incuber 1heure à 37°C.

    si vous pouvez m'aidé de connaître pourquoi ils ont incubé une heure et à 37°C?

    -----


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  3. #2
    piwi

    Re : l'ADN plasmidique

    L'incubation toute la nuit permet d'amplifier le nombre de copies du plasmide (le plasmide se réplique dans les cellules et les cellules se divisent).

    Pour le reste je ne vois pas du tout l'intérêt de resuspendre dans 1ml (normalement c'est 100 µl dans du glucose-EDTA avant de lyser les cellules) et surtout l'intérêt de cette seconde incubation. Totalement useless.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  4. #3
    MaliciaR

    Re : l'ADN plasmidique

    Bonjour,

    Donne la suite, on comprendra peut-être le pourquoi. (Et ça se trouve, le protocole est totalement nouveau et révolutionnaire ).
    Quelle est la composition du tampon B?


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  5. #4
    Yoyo

    Re : l'ADN plasmidique

    Citation Envoyé par MaliciaR Voir le message
    Bonjour,

    Donne la suite, on comprendra peut-être le pourquoi. (Et ça se trouve, le protocole est totalement nouveau et révolutionnaire ).
    Quelle est la composition du tampon B?


    Cordialement,
    A mon avis il y a peu de chance, vu que ca semble sortir tout droit d'un exercice...
    Je suis d'accord avec toi, si au moins on connaissait la composition du tampon B on comprendrai peut etre le pourquoi de cette incubation.
    heureusement qu'on ne fait pas/plus ca! ca quadruplerait mon temps de miniprep

    YOyo

  6. #5
    MaliciaR

    Re : l'ADN plasmidique

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    A mon avis il y a peu de chance, vu que ca semble sortir tout droit d'un exercice...
    Mais si, mais si : parfois, tu as de ces découvertes et de ces protocoles dans les exos...

    Je suis d'accord avec toi, si au moins on connaissait la composition du tampon B on comprendrai peut etre le pourquoi de cette incubation.
    J'espère, oui


    heureusement qu'on ne fait pas/plus ca! ca quadruplerait mon temps de miniprep
    Pour ça, faut engager une technicienne (comme d'autres Bonobos' addict pour les maxipreps ).


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    selmabio

    Re : L'ADN plasmidique

    le tampon B CONTIENT :
    Tris-HCL 0.05M
    EDTA
    ajuster à pH 8 avec HCL
    SACCHAROSE 25%
    LYSOZYME 20mg/ml

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  10. #7
    IngDr

    Re : L'ADN plasmidique

    le lyzozyme est une enzyme servant à perforer la membrane bactérienne pour favoriser la lyse cellulaire. Comme toute enzyme classique, son activité dépend de la température, et en générale, elle sont plus actives à 37° qu'à 4°.
    Cette technique de lyse est (était) utilisée en altérnative à la lyse alcaline qui induit aussi des coupures de l'ADN en plus de lyser les bactos.

    Pour info, le lyzozyme est aussi présent dans certains medicament utilisés pour les maux de gorges.

  11. #8
    Yoyo

    Re : L'ADN plasmidique

    Citation Envoyé par IngDr Voir le message
    le lyzozyme est une enzyme servant à perforer la membrane bactérienne pour favoriser la lyse cellulaire. Comme toute enzyme classique, son activité dépend de la température, et en générale, elle sont plus actives à 37° qu'à 4°.
    c'est exactement pour ca qu'il y a incubation a 37°c en effet! juste pour laisser le temps au lyzozyme d'agir.

    Yoyo

  12. #9
    IngDr

    Re : L'ADN plasmidique

    Citation Envoyé par IngDr Voir le message
    Cette technique de lyse est (était) utilisée en altérnative à la lyse alcaline qui induit aussi des coupures de l'ADN en plus de lyser les bactos.
    pour préciser ma pensée, c'est la lyse alcaline qui peut induire des coupures de l'ADN, ce qui, selon les applications, peut être problématique. Notamment dans le cas des purif sur chlorure de césium (de mémoire, mais là ca remonte à loin !!)

  13. #10
    selmabio

    Re : L'ADN plasmidique

    merci de votre réponse

  14. #11
    MaliciaR

    Re : L'ADN plasmidique

    Bonjour,

    J'utilise un mélange de STET (Sucrose, Triton, EDTA et Tris-HCl) et lysozyme, mais je ne laisse pas incuber pendant 1h à 37°C... Pourtant, elles sont ok, mes preps...
    Pourquoi laisser 1H à 37°C alors qu'on peut faire sans?

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  15. #12
    piwi

    Re : L'ADN plasmidique

    La question est est ce que derrière tu fais une étape de lyse alcaline (SDS 1% NaOH 0.2N)?
    Parce que si tu ne fais pas cela je vois mal quand ton plasmide est libéré. Si tu le fais, je vois mal l'intérêt du lysozyme.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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  17. #13
    MaliciaR

    Re : L'ADN plasmidique

    Non, je ne fais pas de lyse alcaline, j'incube à 100°C pendant 50 sec, puis centrif (15 min à 13200rpm), ensuite je vide le culot immonde et je mets de l'isopropanol.

    La lyse alcaline est une solution plus efficace?

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  18. #14
    Yoyo

    Re : L'ADN plasmidique

    Citation Envoyé par MaliciaR Voir le message
    Non, je ne fais pas de lyse alcaline, j'incube à 100°C pendant 50 sec, puis centrif (15 min à 13200rpm), ensuite je vide le culot immonde et je mets de l'isopropanol.

    La lyse alcaline est une solution plus efficace?

    Cordialement,
    Oui c'est surement beaucoup plus efficace, et aussi beaucoup plus propre!
    La ton ADN est encore avec pleins de protéines! je ne parle meme pas des sels.
    Je suis pas certains que tu puisses garder tes prep bien longtemps.

    Yoyo

  19. #15
    MaliciaR

    Re : L'ADN plasmidique

    Non, on est d'accord sur le temps de conservation... Ce qui est super ch**** c'est de faire la précipitation ensuite si je veux les utiliser et tout ça... Mais ils refusent de faire une lyse alcaline en disant que c'est ainsi que ça marche bien, donc pas de raison de changer... Bref, faut introduire un peu de bio mol chez les biochimistes
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  20. #16
    tortuga

    Re : L'ADN plasmidique

    Citation Envoyé par IngDr Voir le message
    Pour info, le lyzozyme est aussi présent dans certains medicament utilisés pour les maux de gorges.
    Et dans les larmes!

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