Salut,afin d'extraire l'ADN PLASMIDIQUE un groupe de travail a inoculé 5ml de bouillon LB à partir d'une colonie isolée sur milieu gélosé ils ont incubé ce bouillon une nuit à37°C.
si vous pouvez m'aidé de connaître pourquoi ils ont incubé une nuit et à 37°C?
après ils ont centrifugé 1ml de culture pendant 2 minutes à vitesse maximale ,resuspendre le culot dans 1ml de tampon B puis incuber 1heure à 37°C.
si vous pouvez m'aidé de connaître pourquoi ils ont incubé une heure et à 37°C?
L'incubation toute la nuit permet d'amplifier le nombre de copies du plasmide (le plasmide se réplique dans les cellules et les cellules se divisent).
Pour le reste je ne vois pas du tout l'intérêt de resuspendre dans 1ml (normalement c'est 100 µl dans du glucose-EDTA avant de lyser les cellules) et surtout l'intérêt de cette seconde incubation. Totalement useless.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Bonjour,
Donne la suite, on comprendra peut-être le pourquoi. (Et ça se trouve, le protocole est totalement nouveau et révolutionnaire).
Quelle est la composition du tampon B?
Cordialement,
A mon avis il y a peu de chance, vu que ca semble sortir tout droit d'un exercice...Envoyé par MaliciaR
Bonjour,
Donne la suite, on comprendra peut-être le pourquoi. (Et ça se trouve, le protocole est totalement nouveau et révolutionnaire
Quelle est la composition du tampon B?
Cordialement,
Je suis d'accord avec toi, si au moins on connaissait la composition du tampon B on comprendrai peut etre le pourquoi de cette incubation.
heureusement qu'on ne fait pas/plus ca! ca quadruplerait mon temps de miniprep
YOyo
Mais si, mais si : parfois, tu as de ces découvertes et de ces protocoles dans les exos...
J'espère, ouiJe suis d'accord avec toi, si au moins on connaissait la composition du tampon B on comprendrai peut etre le pourquoi de cette incubation.
Pour ça, faut engager une technicienneheureusement qu'on ne fait pas/plus ca! ca quadruplerait mon temps de miniprep).
Cordialement,
le tampon B CONTIENT :
Tris-HCL 0.05M
EDTA
ajuster à pH 8 avec HCL
SACCHAROSE 25%
LYSOZYME 20mg/ml
le lyzozyme est une enzyme servant à perforer la membrane bactérienne pour favoriser la lyse cellulaire. Comme toute enzyme classique, son activité dépend de la température, et en générale, elle sont plus actives à 37° qu'à 4°.
Cette technique de lyse est (était) utilisée en altérnative à la lyse alcaline qui induit aussi des coupures de l'ADN en plus de lyser les bactos.
Pour info, le lyzozyme est aussi présent dans certains medicament utilisés pour les maux de gorges.
c'est exactement pour ca qu'il y a incubation a 37°c en effet! juste pour laisser le temps au lyzozyme d'agir.
Yoyo
pour préciser ma pensée, c'est la lyse alcaline qui peut induire des coupures de l'ADN, ce qui, selon les applications, peut être problématique. Notamment dans le cas des purif sur chlorure de césium (de mémoire, mais là ca remonte à loin !!)
merci de votre réponse
Bonjour,
J'utilise un mélange de STET (Sucrose, Triton, EDTA et Tris-HCl) et lysozyme, mais je ne laisse pas incuber pendant 1h à 37°C... Pourtant, elles sont ok, mes preps...
Pourquoi laisser 1H à 37°C alors qu'on peut faire sans?
Cordialement,
La question est est ce que derrière tu fais une étape de lyse alcaline (SDS 1% NaOH 0.2N)?
Parce que si tu ne fais pas cela je vois mal quand ton plasmide est libéré. Si tu le fais, je vois mal l'intérêt du lysozyme.
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Non, je ne fais pas de lyse alcaline, j'incube à 100°C pendant 50 sec, puis centrif (15 min à 13200rpm), ensuite je vide le culot immonde et je mets de l'isopropanol.
La lyse alcaline est une solution plus efficace?
Cordialement,
Oui c'est surement beaucoup plus efficace, et aussi beaucoup plus propre!
La ton ADN est encore avec pleins de protéines! je ne parle meme pas des sels.
Je suis pas certains que tu puisses garder tes prep bien longtemps.
Yoyo
Non, on est d'accord sur le temps de conservation... Ce qui est super ch**** c'est de faire la précipitation ensuite si je veux les utiliser et tout ça... Mais ils refusent de faire une lyse alcaline en disant que c'est ainsi que ça marche bien, donc pas de raison de changer... Bref, faut introduire un peu de bio mol chez les biochimistes
Et dans les larmes!
