extractiobn d'ADN plasmidique

[invitedd6cfa36]

bonjour à tous;
J'ai eu un question dans le TP de biologie moléculaire dans ce qui conserne la méthode d'éxtraction de l'ADN plasmidique et la détermination de la température de fusion c'est que c'est quoi le rôle du sel dans la solution.
et merci à vous d'avance.
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[jmbowie]

bonjour à tous;
J'ai eu un question dans le TP de biologie moléculaire dans ce qui conserne la méthode d'éxtraction de l'ADN plasmidique et la détermination de la température de fusion c'est que c'est quoi le rôle du sel dans la solution.
et merci à vous d'avance.

Pendant votre TP, comment avez-vous extrait votre ADN?

Si vous avez utiliser un sel appelé Acétate d'Ammonium, c'est un composé qui permet la précipitation de l'ADN

[invitedd6cfa36]

Pendant votre TP, comment avez-vous extrait votre ADN?

Si vous avez utiliser un sel appelé Acétate d'Ammonium, c'est un composé qui permet la précipitation de l'ADN

Tout d'abord merci à votre réponse
pendant TP , on a préparé notre solution en trois étapes. Lapremière était l'ajout d'un tampon GET puisune solution NaOH et SDS et enfin une solution K-acétate

[jmbowie]

Tout d'abord merci à votre réponse
pendant TP , on a préparé notre solution en trois étapes. Lapremière était l'ajout d'un tampon GET puisune solution NaOH et SDS et enfin une solution K-acétate

Aurais-tu la composition du tampon GET?

Il semble que tu aies procédés par lyse alcaline:

- Lyse des cellules (avec le tampon GET sur un culot de cellules)
- Dénaturation des protéines au SDS
- Neutralisation à l'acétate de sodium : un gros précipité blanc a du apparaitre, ce sont les protéines
- Précipitation des ADN ou colonnes de kit?

[A voir en vidéo sur Futura]

[MaliciaR]

- Précipitation des ADN ou colonnes de kit?

Stp, ressaisis-toi : des colonnes de kit dans un TP? On n'a parfois même plus d'eppendorfs...

Cordialement,

[jmbowie]

Stp, ressaisis-toi : des colonnes de kit dans un TP? On n'a parfois même plus d'eppendorfs...

Cordialement,

En France oui

[MaliciaR]

En France oui

Beh c'est de la France que je te parle aussi

Sinon, GET c'est Glucose EDTA Tris-HCL pH 8.

Cordialement,

[jmbowie]

C'est donc juste un tampon de resuspension. La lyse est donc faite qu'avec le SDS (même pas un peu de protéase alcaline?)

[MaliciaR]

Le SDS et le NaOH. Pas de protéase, normalement. (Elles sont pauvres, les facs )
C'est à la fin qu'on rajoute la TE-RNAse, mais c'est une autre question là...

[piwi]

Moi ce que je fais faire à mes étudiants c'est entre autre, une miniprep classique (qui marche très bien) et une extraction phénol/chloroforme.

Ca permet de maniper un peu et surtout d'expliquer le principe.
Voilà un extrait de ce qui pourrait être une correction d'une partie du rapport que je demande en TP.

MATERIEL & METHODE
I miniprep.
10 ml de culture bactérienne sont centrifugés afin de concentrer les bactéries dans un petit volume V (ici 100µl) d’une solution Tris-EDTA-glucose. Elles sont ensuite lysées 5 minutes dans une solution Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) 0.65% et de la soude, NaOH 0.15M (ajout de 2V d’une solution SDS1%, NaOH 0.2M). Le SDS est un détergeant ionique servant à lyser les membranes et à dénaturer les protéines et les acides nucléiques (rupture des liaisons hydrogènes et des liaisons hydrophobes). NaOH, base forte, induit une augmentation du pH et dénature aussi les protéines et les acides nucléiques.
La soude est ensuite neutralisée par de l’acétate de potassium (KAc) 1M en concentration finale (ajout de 1.5V d’une solution de KAc 3M.). Ceci induit la renaturation des macromolécules. L’ADN génomique et la plupart des protéines sont des molécules trop grosses pour retrouver leur conformation native et toutes ces molécules établissent des liaisons les unes avec les autres, formant un précipité blanchâtre Le plasmide étant petit il retrouve sa conformation native, est exclu du précipité et reste en solution. Il en va de même pour les petites protéines. L’ensemble est centrifugé 5 minutes à 13 000 tours/minutes et le surnageant est récupéré.

II purification des plasmides.
On dispose d’une solution contenant les plasmides et de petites protéines. Du phénol et du chloroforme/alcool isoamylique sont ajoutés volume à volume (ici 200 µl) et l’ensemble est homogénéisé. Les protéines sont solubles dans le phénol alors que les acides nucléiques sont solubles dans le chloroforme. (L’alcool isoamylique empêche la formation de mousse durant l’émulsion). L’ensemble est ensuite centrifugé 5 minutes à 13 000 tours minutes afin de séparer deux phases. La phase supérieur (V/2), aqueuse, contenant les acides nucléiques (donc les plasmides) est récupérée. Les plasmides sont précipités dans 2V d’éthanol (EtOH) absolu (EtOH 70% final)
On récupère les plasmides en centrifugeant 5 minutes à 13 000 tours minutes, le surnageant est éliminés et les sels restants sont éliminés en ajoutant V d’EtOH 70%. On centrifuge 5 minutes à 13 000 tours/minutes et le surnageant est éliminé, l’EtOH 70% est laissé à évaporer à l’air libre. Les plasmides sont enfin repris dans tu tampon d’élution (ici 25 µl).
La qualité des plasmides est évaluée en faisant migrer 5 µl de la miniprep + tampon de charge dans un gel d’agarose 1%. En principe, on peut espérer obtenir ~5µg de plasmides par cette méthode.

Cordialement,
piwi

[MaliciaR]

Ton protocole de miniprep est pratiquement le même que celui qu'on a fait en TP, à la différence près qu'on ne nous explique pas à quoi sert chaque solution de traitement

Cordialement,

[piwi]

C'est un protocole standard. J'utilise le même au labo quand je veux faire une miniprep. J'ajoute juste de la RNase.

Après pour les explications, ça dépend des profs... Y en a des bons, y en a des mauvais

Sur ce je retourne préparer mes cours de biologie du développement

piwi

[MaliciaR]

C'est un protocole standard. J'utilise le même au labo quand je veux faire une miniprep. J'ajoute juste de la RNase.

Voilà quelqu'un qui n'est pas dépensier. Il fait son protocole peinard et n'utilise pas de kits qui coûtent la peau des fesses

Après pour les explications, ça dépend des profs... Y en a des bons, y en a des mauvais

Je ne l'ai pas dit mais l'ai pensé très fort

Cordialement,