Precipitation adn plasmidique

[invite8135ca60]

Bonjour, après une extraction d'adn plasmidique avec un kit qiagen, je me retrouve avec de faibles concentrations de plasmide. Je souhaterais donc le concentrer un peu afin de pouvoir par la suite le sequencer.
Je cherche donc à precipiter mon adn pour le reprendre dans un volume plus petit, quel est le protocole à utiliser.
J'ai dejà essayer avec de l'ethanol absolu et acetate de sodium mais j'ai laissé precipiter 1h à temperature ambiante or j'entend des gens dire que le mieux serait de le laisser toute une nuit à -80°C.
J'aurais donc voulu savoir si quelqu'un avit un protocole qui marche bien.
Merci.
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[Jean-Luc P]

or j'entend des gens dire que le mieux serait de le laisser toute une nuit à -80°C.
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Sûrement pas à -80 °C ! Tu vas geler l'alcool et c'est tout ce que tu vas obtenir !

30 min à 0-4 °C suffisent , en-deça ça ne change rien.
Tu peux essayer à -20°C, normalement ça ne devrait pas geler mais ce n'est pas loin...

Si tu n'obtient pas assez d'ADN, repars avec une culture plus importante, ou essaie de ne pas dépasser la phase de plateau lors de la pousse de tes micro-organismes.

[invitec9f0f895]

salut

La precipitation peut meme se faire a temperature ambiante (la tp° n'influence pas la precipitation contrairement a certaine croyance).
Si tu as de faibles concentration d'ADN je te conseille un entraineur pour precipiter ton ADN sinon tu risques d'en perdre.
Autre solution tu rajoute a ta culture sur la nuit un peu de chloramphenicol pendant quelques heures. Ca bloque la multiplication des bacteries mais n'affecte pas pas la replication de l'ADN. donc tu augmente la quantité de plasmide dans tes bacteries.

Yoyo

[invite84b0382c]

salut

La precipitation peut meme se faire a temperature ambiante (la tp° n'influence pas la precipitation contrairement a certaine croyance).

Yoyo

Effectivement ca n'influence pas la précipitation. Je pense que ces croyances sont basées sur le fait que lorsqu'on congèle a -20°C, on obtient une sorte de précipité visible à l'oeil nu.

Pourtant, cette précipitation peut tout à fait se faire à RT

Pour concentrer ton ADN, tu peux éventuellement utiliser un désicateur pour évaporer un peu d'eau de ton produit de purification d'ADN plasmidique.
Surveille quand même pour ne pas le laisser trop longtemps dedans
Certe l'ADN est stable mais bon, à sec, je donne pas chère de son état

Akïn

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8135ca60]

citation: yoyo:
Si tu as de faibles concentration d'ADN je te conseille un entraineur pour precipiter ton ADN sinon tu risques d'en perdre.


C'est quoi un entraineur????
A part ça merci pour vos precieux conseils.
Si d'autres personnes ont d'autres suggestions je suis preneur!!!