Transcription in-vitro

[invite97d0881c]

Bonsoir,

Je me demandais pourquoi, lors d'une transcription in-vitro, on doit obligatoirement linéariser le vecteur contenant l'ADN d'intérêt. Par exemple j'ai cloné mon ADN dans le vecteur pSFV1 pour le transcrire in-vitro je dois linéariser le vecteur à l'aide de l'enzyme Spe1 dont le site est situé juste avant le promoteur SP6 nécessaire à la transcription. Puisque mon vecteur c'est de l'ADN double brin, l'ARN polymérase devrait pouvoir se fixer sur le promoteur même si mon vecteur est encore circularisé non ?
Je vous en remercie d'avance. Bonne soirée
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[invitea4b00eb7]

Bonjour,

Normalement on linéarise un plasmide pour pouvoir mettre un terme à la transcription in vitro. Si on ne linéarise pas, la polymérase transcrit et ne s'arrête pas. Je trouve ça étonnant de linéariser pour aider la polymérase à transcrire. Un vecteur de clonage est constitué de deux promoteurs, un qui sera en amont de notre gène (ADNc) et l'autre en aval. Habituellement, on linéarise en aval ce qui ne permet pas au promoteur en aval de fixer le facteur de transcription. En revanche, en amont le facteur de transcription se fixe, "court" puis "tombe" c'est ce qu'on appelle maintenant le RUN OFF. Si vous avez coupé au niveau du promoteur SP6 et que vous utilisez le facteur SP6, c'est étonnant que vous ayez de la transcription....mais je ne suis qu'étudiant!

En espérant avoir répondu à votre question.

Cordialement,

Jérém

[invite97d0881c]

Merci pour cette réponse. En fait le site de coupure est plutôt situé à la fin de la queue poly A et non juste avant le promoteur SP6 ce qui correspond à ce que vous avez dit. Je ne savais pas que l'on appelais cela un run OFF, après avoir fait quelques petites recherches dessus c'est beaucoup plus claire maintenant.
Merci , Bonne soirée