Probleme d'induction de GST dans bacterie

[invite90f5edc9]

Bonjour à tous et merci d’avance pour votre aide,

Comme écrit dans mon titre on essaye d’induire l’expression de la GST et d’une protéine fusionné avec la GST dans des BL-21 avec de l’IPTG. Le vecteur est PGEX-4T3.
Le protocole a été mis au point dans mon lab depuis un certain temps et la post-doc (nouvelle venue dans le lab) qui essai cette technique a de l’expérience dans le domaine.

Le protocole est assez classique : transformation de bactéries avec 5ng de plasmide par choc thermique et sélection sur pétrie avec d’ampicilline.
Jusque-là ça marche : on a des colonies et les PCR sur colonies montrent que les bactéries ont les plasmides.

Après on sélectionne une colonie et on fait pousser overnight dans 2ml de LB+ampi+glucose.
Le lendemain on récupère 800ul de ces bactéries et on les faits pousser dans 100 ml de LB+ampi jusqu’à obtenir une DO a 600nm de 0.6 à 0.7.

Une fois que c’est fait on ajoute l’IPTG a 0.5mM et on fait pousser 2H à 37℃ suivit de 2H à 30℃.
On a récupéré cette GST en utilisant des billes et on les a fait migrer sur gel de poly-acrylamide suivit d’un marquage au bleu de coomassie. On voit clairement les bandes correspondantes à la GST et la GST fusionnés a la protéine (aux bonnes tailles) mais les bandes sont très faibles.

Si on lyse les bactéries après l’induction par IPTG et qu’on fait migrer sur gel de poly-acrylamide suivit d’un marquage au bleu de coomassie on voit rien, ou en tout cas pas les grosses patates attendue.

On est désespéré car on a tout essayé : différentes billes, différentes ampicillines, différentes souches de bactéries (DH5α), différentes IPTG a différentes concentration (1mM). Différents temps d’induction a différentes températures (4H à 37℃ au lieu de 2H à 37℃ suivit de 2H à 30℃) mais rien à faire.

Personnellement je pense que c’est un problème avec le LB mais personne ne m’écoute (je suis inexpérimenté pour cette technique).

Donc si quelqu’un a déjà eu ce problème ou à des idées son aide serait très appréciée.

Merci d'avance!
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[invite74b9e03b]

Quelle est la nature de la protéine que vous avez fusionnée à la GST ? Cela conditionnera la souche que vous utiliserez.

En effet, assurez vous que le milieu que vous utilisez pour l'induction ne contiennent absoluement pas de glucose. Changez votre LB et changez votre stock IPTG (regardez si vous avez un lot différent).

Enfin a en croire la carte plasmidique, votre protéine serait sous le contrôle d'un promoteur tac je vous conseil cette littérature,. http://www.sciencedirect.com/science...78111988904404 vous y trouverez des éléments de réponse.

Si le promoteur est dose dépendant augmentez la concentration d'IPTG. Ce promoteur ne semble cependant pas être un promoteur très fort.
Si votre but est de surexprimer la protéine, je vous conseil une construction classique type promoteur T7 et une souche BL21(DE3)*pLys

Camu

[invite90f5edc9]

Merci pour ta reponse Camu.

Ce qui est étrange est que cette technique est censée être au point. Avec les conditions indiqué le plasmide codant pour la GST seul devrait déjà nous donner une bande bien visible après marquage au bleu de coomassie sur gel de poly-acrylamide. Autrement on a déjà essayé de doubler la concentration d'IPTG (et aussi essayé l'IPTG d'un autre labo).
Sinon la protéine fusionné a la GST est un anticorps.

Je vais lire l'article que vous me conseillez.

Bon week-end et encore merci de ton aide.

[invitec9f0f895]

Salut,

Essaye d'induire sur toute la nuit à 30°C.

Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec0b62935]

1. Est-ce que cette construction a déjà été utilisée avec succès ? Si oui, rend-toi au 2. Si non, rend-toi au 3.
2. Dans ce cas il n’y a pas de raison que ça échoue, contacte la personne qui l’a déjà fait et compare les protocoles.
3. Pour mieux cerner ton problème, tu commences par répéter ton protocole de production en utilisant le vecteur vide au lieu de ta construction. La GST est une protéine très facile à produire donc tu en auras des tonnes si ton protocole est correct. Rend toi au 4 si tu as beaucoup de GST, sinon rend toi au 7
4. Tu as des tonnes de GST mais ta protéine ne se produit pas dans ces conditions. C’est ce qui arrive pour les protéines un peu capricieuses (donc 90% du total ?). La protéine se replie mal et au final elle s’agrège ou elle est dégradée, ce qui revient au même pour toi puisque tu n’as pas de protéine au final. C’est une situation bien plus courante que ne le laissent croire les articles et autres cours de biochimie. Dans ce cas tu répètes la production en diminuant la température d’expression. Personnellement je ne produis jamais à 37°, lors de l’induction je baisse à 18° et je produis ON. Si tu as une bande importante de protéine, va au 5, sinon va au 6
5. Ca marche, c’est le plus important. Tu peux éventuellement utiliser d’autres souches d’expression pour améliorer les choses mais la différence sera probablement assez faible. Si tu vois une dégradation importante (de nombreuses bandes de masses plus faibles que ta protéine de fusion, tu peux forcer la dose sur les inhibiteurs de protéase lors de la lyse des bactéries.
6. Si tu n’as toujours pas une bande évidente après passage sur les billes, ça devient embêtant, c’est sans doute que la construction ne permet pas l’expression et il faut en définir une autre. Pour aller plus loin, il faudra soit que tu trouves un bon biochimiste pour t’aider soit que tu donnes la séquence. Je ne dis pas ça pour te faire peur mais je jette à peu près 95% de mes constructions à ce stade et certains laboratoires pourtant qui publient tous les ans dans Nature ou Science montent sans problème à 99%.
7. Si tu n’arrives pas à produire la GST seule, c’est ton protocole de production qui a un problème. Essaie un autre protocole avec le vecteur vide d’abord puis une fois que ça marchera tu essaieras avec ta protéine de fusion.

[invite537c5180]

J´avais eu le même probléme l´année derniére, en plus moi je faisais des litres de culture, je ne te raconte pas la galére . Pour moi c´était : BL21 Star(DE3), plasmide pGEX-2T avec fusion GST-toxine bactérienne, promoteur tac et induction á l´IPTG. Finalement la solution dans mon cas pour avoir une assez bonne quantité de protéines recombinantes, était d´induire á une DO tardive de 1.0 et de laisser pousser ensuite mes cellules 3h et 30mn. Je ne sais pas pourquoi ca marchait seulement sous ces conditions !! .

[invite90f5edc9]

Merci pour vos réponses.
A YOYO: je suggérerais l'idée a mon PI.
A Svenn: On se contente de re-utiliser le protocole mis au point dans notre lab. Donc la manip a déjà marché avant. Et cette manip étant assez simple, on est un peu désespéré de ne pas pouvoir même la GST non fusionné...
A Microbiologiste: Comme dit précédemment, si le problème venait juste de la protéine GST fusionné ce serait compréhensible. Mais la c'est la GST seul qu'on arrive pas a induire.

[invitefb4af953]

Salut,

Persso la première chose que je ferais c'est transfo, selection, culture overnight et miniprep de plasmide. Après digestion par restriction et tu sort la GST ou ton insert. Et là t'es sur que la construction est bonne déjà ça me semble essentielle.
Après en BL21 normalement on fait un test d'expression pour voir si ta protéine est soluble (excrété) ou insoluble (forme des corps d'inclusions). C'est essentiel par ce que tu adapte le protocole d'extraction de ce cas là.
Et j'ai rien capté à ton truc de bille là, pour moi la GST ça se purifie en colonne de chromato d'affinité (GST pull down assay). C'est le cas ? sinon tu ferais de te renseigner là dessus.

Et c'est pas la peine d'incriminer le LB les bactérie sa pousse sur n'importe quoi c'est surement pas ça qui peut varier ton induction. J'imagine pas que l'IPTG soit en cause non plus.
Les raisons les plus probable c'est la protéine est en corps d'inclusion. Ou bien aussi essaye induction overnight à 37°C 0.1mM IPTG. Une trop forte induction est toxique.

En dernier recours tu fouette les bactéries

[invite90f5edc9]

J'avoue que si j'avais des fouets a la bonne taille elles en prendraient pour leur grade...Sinon mon boss veut pas entendre pas entendre parler de problème de plasmides. La post-doc qui travaille avec moi désespère a ne pas réussir cette manip de routine (qu'elle faisait toutes les semaines dans son précédent lab). Peut-être qu'elle pourra le faire changer d'avis.

[invitec0b62935]

Dans ce cas, si la production a déjà marché avec le même plasmide et la même souche bactérienne, le mieux est de refaire tous vos tampons, les stocks d'antibio t d'IPTG ... et de recommencer. Si un tampon a été mal fait, ça ira plus vite de refaire des nouveaux tampons que de trouver l'erreur. Eventuellement ça peut valoir le coup de vérifier le pH du LB.

Si vous travaillez sur une colonne d'affinité, il se peut aussi que la colonne soit abimée et qu'elle ne retienne plus rien.

Edit : bien sur il faut refaire une transformation, l'efficacité de la production diminuant en général avec le temps depuis la transfo. Je n'utilise jamais pour la production de transfo vieilles de plus de 3 jours.