Projet clonage et expression d'un gène

[Louvetaria]

Bonjour,

Pour mes études j'ai comme projet de cloner et d'exprimer un gène codant pour une protéine membranaire. Le mieux serait d'utiliser comme hote E. Coli.
J'ai fais pas mal de recherche, et voulais tenter de cloner le gène codant pour la GlpT, la glycerol 3 phophate transporter.
J'ai trouvé plusieurs publications à propos, mais la manipulation a l'air compliqué, et j'ai un temps très restreint pour mes manipulations. Je ne veux pas me lancer dans quelque chose de compliqué, mes profs cherchent juste à évaluer mes compétences pratiques en matière de clonage et d'expression. De plus je valide mon Master 1 sur ce projet, et j'ai deux semaines de laboratoire libre pour le réaliser. Connaissez-vous une autre protéine membranaire qu'il serait possible de cloner et d'exprimer avec des résultats corrects.

Je vous remercie d'avance

Louvetaria
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[Louvetaria]

Personne n'aurait une idée?

[biseibutsu]

Bonjour,

Je ne m'y connais pas du tout sur les protéines membranaires de bactéries.
Mais je propose comme même la lecture de ce papier, qui devrait donner une idée de nom pour en choisir une => Assembly of bacterial inner membrane proteins
Chez la levure, il y a un papier qui est sorti l'année dernière sur un système d'expression simple et efficace des protéines membranaires : Rapid expression screening of eukaryotic membrane proteins in Pichia pastoris.

Après, je suis presque sur que le labo d’accueil a déjà les plasmides de quelques protéines membranaires (car si il faut en commander un, cela va prendre un bout de temps) ainsi que les modèles cellulaires et protocoles pour tout réaliser (deux semaines, c'est super court!), du clonage à la détection/quantification de la protéine d'intérêt.

Si le but est de réaliser une protéine membranaire fluorescente, le plus difficile va être de déterminer l'endroit de la protéine où ajouter la "fonction" fluorescente. Pour cela, je peux expliquer, mais encore une fois, je pense que les personnes du labo (ou les profs) sont plus qualifiés dans ce cas.

Bonne lecture!

[Louvetaria]

Merci pour tes conseils. J'ai décidé d'utiliser le plasmid pET-15b possedant un His-tag et me permettant de purifier ma protéine par une colonne d'affinité au nikel.

Pour cloner mon gène, je dois d'abord l'amplifier par PCR. Pour celà j'ai décidé d'utiliser la souche DH5alpha de Escherichia Coli. J'ai donc préparé la souche, je l'ai déposé sur ma plaque d'agar et l'ai laissé incuber toute la nuit pour que la bactérie se multiplie et produit des colonies. Ma prochaine étape est donc de récupérer une ou plusieurs colonies (je pense 4) et de les laisser se développer dans un milieu LB. Quelle est la prochaine étape pour pouvoir utiliser correctement mon ADN pour une PCR afin d'amplifier mon gène?

Merci d'avance

[A voir en vidéo sur Futura]

[biseibutsu]

Il faut ensuite commander/créer les bonnes amorces pour amplifier le fragments d'ADN désiré.
Pour faciliter le clonage, il est possible d'ajouter à l'extrémité des amorces des sites de restriction (cohésifs, c'est mieux ). Une fois les amorces choisis et produites, la PCR peut se faire de deux manières. Soit sur colonie directement (prendre une colonie (ou moitié de)), puis amplifier directement l'ADN d'intéret (avec les bonnes température et temps d'élongation). Soit en purifiant de l'ADN bactérien (ou plasmidique, cela dépend où se trouve la séquence d'intérêt) à partir d'un bouillon de culture (cela permet généralement d'obtenir de l'ADN plus propre.
Une fois que le résultat de l'amplification a été vérifier (et digérer) sur gel, il en possible de cloner le fragment d'intérêt dans le vecteur voulu (ici pET-15b).