Fixer des protéines dans un gel

[biseibutsu]

Bonjour à tous,

Je vais poser une question (très) technique, donc préparez vous

Est-il possible de fixer de façon covalente des protéines dans un gel de poly-acrylamide?

Je ne veux pas les faire précipiter ou autres, je veux que mes protéines, après migration, soit définitivement fixer dans le gel à l'endroit où elles se trouvent.

Voilà, si vous avez des idées ou suggestions, je suis preneur (et testeur)

Merci!
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[noir_ecaille]

De façon covalente ça me paraît bizarre :, cela ne va-t-il pas casser la cohérence du gel si on altère la structure au niveau covalent ? On peut toujours faire un essai quand même.

Ma suggestion : On peut tenter une amidation sur des fonctions carboxyles ou une estérification sur des groupements amines via un tag ?

[TanguyE]

Salut,

Tu veux en faire quoi exactement, parce que j'ai aucune idée sur la façon de procéder pour fixer des protéines dans un gel, par contre il y aurait peut être une solution autre à ton problème.

[biseibutsu]

Merci à tous les deux

Je souhaite, après fixation des protéines dans mon gel, regarder ces protéines (fluorescente) au microscope (capable de voir une molécule...).
Mon gel est déjà fixé de façon covalente à la lamelle de verre, donc il n'est pas censé bouger. Cependant, lorsque je laisse le gel sécher (ce qui est rapide, vu qu'il ne fait que 20um d'épaisseur), il y a une légère diffusion des petites protéines, mais c'est tout (les grosses sont trop grosse). Par contre, dès que j'essaie de les fixer (avec du TCA, par exemple), là, je perds carrément les petites protéines (diffusion dans le tampon de fixation + dans les lavages, probablement), et les grosses sont également plus faibles...
Je suis entrain de regarder les différents cross-linker, mais avec des catalogues 100% en Japonais, la tache n'est pas facile (et le net ne m'a rien appris pour le moment).

[A voir en vidéo sur Futura]

[TanguyE]

Salut,

Tu as essayé le formaldehyde, genre 4% comme pour fixer des cellules. J'ai trouvé un abstract qui en parle: http://www.sciencedirect.com/science...03269782901816.

Sinon je sèche

[noir_ecaille]

Je vais proposer un truc barbare... Avant de faire sécher, en passant la plaque dans un microonde pleine puissance quelques seconde, les protéines seront peut-être dénaturées et ainsi fixées... Mais c'est barbare... Y'a des protéines qui seront franchement abîmées...

Sinon on peut tenter de seulement vaporiser le tampon de fixation et laisser sécher à plusieurs reprises avant lavage.

Perso je sèche pour le cross-linkage.

[Flyingbike]

Et une fixation du genre acide acétique-methanol ?

[biseibutsu]

Merci à tous de vos réponses.

noir_ecaille, tu n'es pas la seule à sécher complètement sur le cross linkage, même les différentes companies n'en ont pas. En même temps, il faut reconnaitre qu'une fois polymérisé, le polyacrilamide est bien inerte... Difficile de faire réagir quelque chose avec (et c'est bien le but, en fait!).

J'ai enfin reçu un produit dont j'avais besoin afin de bien fixer le gel à la lamelle de verre (Bind-Silane), et je l'ai déjà essayé. Le gel ne bouge plus d'un pouce, même sur les bords . Alors qu'avant, c'était un peu la guerre...

Je vais du coups tenter un peu un mix de ce que vous me proposez, avec une déshydratation/fixation du gel au méthanol suivit d'une pulvérisation du tampon de fixation (formaldéhyde avec éthanol), puis lavage (ou pas, je vais tester)... Je vous tiens au courant, mais ce n'est pas pour tout de suite (une autre expérience en parallèle...)

Encore merci à vous!

[noir_ecaille]

EDIT : Plutôt que "vaporiser", asperger avec le tampon de fixation (avec un pistolet façon nettoyant à vitre/brumisateur) ^^;


On attend tes résultats