Bonjour
Je souhaite faire un double suivi fluorescent d'une protéine. Pour mon experience je dois utiliser rsCherryRev. Celle ci est exitee à 572nm, elle emet à 608nm mais il faut aussi prendre en considération ses switch on et off :/ qui se font respectivement à 550 et 450nm.
Est ce que quelqu'un connaitrait un fluorochrome que je peux utiliser à côte?
Merci d'avance
Cela dépend de comment vous voulez l'utiliser, mais aussi de votre matériel. En fusion, en marquage anticorps ? etc ?
il existe énormement de fluorochromes qui ne recoupent pas vos longueurs d'onde, notamment dans le rouge profond (autour des 700), en IR (autour des 800) ou alors en dessous vers le bleu voire UV (350-400)
Bonsoir et merci pour votre réponse
J'aimerais faire une protéine fusion avec 2 fluorochromes différents, l'un doit être photoréversible pour une expérience de SMPB répétée et l'un toujours activé, c'est donc une protéine fusion.
Je compte aussi rechercher d'autres fluorochromes photoréversibles possibles me permettant plus de manœuvre, j'ai, par exemple trouvé la rsEGFP qui me permettrait plus de manoeuvre : ex493 em510, on488 off405.
je dois avouer ne pas avoir beaucoup d'expérience pour la fluorescence, la proximité des longueurs d'onde ne poserait t'il pas un problème pour la mesure d'intensité ?
donc deja il faut un fluo de nature protéique. Cela limite énormément les possibilités puisque en gros il faut condamner tout le domaine situé entre 450 et 608 ! Avec une marge de sécurité !
Je ne connais pas votre problématique mais il n'est pas possible de rajouter un TAG, TAG qui servira a accrocher ensuite un fluo non protéique exogène ?
Je sais qu'il existe des adaptateurs de ce genre qui permettent de mettre a peu près n'importe quoi sur n'importe quoi (genre lego)
Ca ouvre des possibilités, mais il faut réfléchir a la perméabilité du fluo, sa compatibilité avec le vivant, etc.
Je vois :/
Je dois pouvoir suivre la dynamique et la composition d'un complexe d'homo-oligomère près de la membrane d'une protéine vivante. L'utilisation de la microscopie de fluorescence est obligatoire dans ce devoir.
Nous avons donc choisi (avec notre prof) d'utiliser cette méthode SMPB avec illumination par TIRF. Il nous faut donc un fluorochrome pour cette manip, nous souhaitons un photoréversible pour pouvoir suivre la taille de ces complexes dans le temps mais aussi un fluorochrome pour nous permettre de voir ces fluorochromes de façon constante au cours du temps pour une étude dynamique.
Je pensais que pur travailler dans le vivant une protéine de fusion était presque obligatoire mais encore une fois mes connaissances dans ce domaine sont limitées.
Entre 450 et 608nm ?Pourquoi cela ? La GFP et ses dérivés ne sont ils pas dans ces longueur d'onde en étant protéique ?
Je voulais dire qu'il ne faut PAS marcher entre 450 et 608 parce que votre rsCherryRev est dans ce coin la. Il faut donc se placer au dessus ou au dessous. Si vous excitez la GFP a 488 vous risquez d'activer la Cherry. Il faudrait les spectres précis d'excitation, d'émission et d'activation pour être surs.
En ce qui concerne les fluorochromes non protéiques compatibles avec le vivant, je sais juste que cela existe mais mes connaissances s'arretent la.
D'accord mercij'avais mal compris.
je vais continuer mes recherches alors ! Merci beaucoup pour vos renseignements
