Difficulté d'interprétation de gel d'électrophorèse

[Bloushblouck]

Bonjour,

Alors voilà j'ai des difficultés à interpréter mon gel d'électrophorèse, enfin je me dis juste que c'est pas normal.

Je vous présente le truc avec le résultat et ensuite je vous donnerais mon interprétation mais j'avoue d'autre avis m'aiderais ^^

Alors le but de cette manip était de cribler des plasmides par digestion
- donc j'ai extrait l'ADN plasmidique grâce a un kit d'extraction nucleospin Macherey Nagel
- puis j'ai digéré mes plasmides par BamHI et HindIII à 37° pendant 2h
J'ai fait migrer mes plasmides digérés et non digérés dans un gel d'agarose à 1%, selon le plan suivant:
Puits 1 : pcDNABaxHy --> non digéré
Puits 2 : pcDNABaxHy --> digéré
Puits 3 : pcDNABaxHy --> non digéré
Puits 4 : pcDNABaxHy --> digéré
Puits 5 : rien
Puits 6 : Marqueur smart ladder
Puits 7 : rien
Puits 8 : pcDNA3p53Hy --> non digéré
Puits 9 : pcDNA3p53Hy --> digéré
Puits 10 : pcDNA3p53Hy --> non digéré
Puits 11 : pcDNA3p53Hy --> digéré
Puits 12 : rien

(J'espère que la pièce jointe va s'afficher sinon vous pourrez pas beaucoup m'aider )

Alors je m'attendais pour pcDNABaxHy digéré à 2 fragments : 1 à 452pb (ok) et 1 à 5600pb (ok)
Pour pcDNA3p53Hy digéré à un seul fragment à 6800pb (ok)
Pour les plasmides non digérés je m'attendais à une bande sans vraiment savoir où elle allait migrer.

Sauf que voilà j'ai une bande en plus à 4000 pb pour tout le monde donc je ne comprend pas ce que c'est surtout qu'on dirait que la bande s'est dédoublée ... Bref c'est étrange...

Mon interprétation manque de logique car je me suis dis
- pour les digérés : la bande en plus peut s'expliquer par le fait la digestion n'a pas été complète et qu'il reste des plasmides à l'état superenroulé
- pour les non digérés : ça marche pas vraiment car si la bande à 4000 est l'état superenroulé alors il devrait être majoritaire et ça voudrait dire que le plasmide linéaire migre au même endroit que le plasmide circulaire ouvert.

Voilà mon cheminement mais je trouve que ça manque de logique ou alors c'est un problème de l'électrophorèse en elle même (peigne mal lavé ou autre)?

Et si quelqu'un sait pourquoi il y a des grosses bavures au niveau des plasmides digérés ça m'intrigue ...

Voilà merci de l'aide que vous pourrez m'apporter je l'espère.
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[Yoyo]

Salut

Tu n'indiques pas la concentration de ton gel, mais vu que ton fragment le plus haut fait 5600, tu n'arriveras pas à voir une différence entre la forme coupée et non coupée (400pb) ce n'est pas assez dans cette zone de migration.
la manip a fonctionnée puisque tu vois ta bande a 400 la ou il faut. Pour les bandes suppérieures je dirais que c'est une aberration de migration car tu as trop de matériel dans ton puit.

YOyo

[Bloushblouck]

J ai noté que mon gel etais a 1% ^^

Mais comment ça se fait que c est une aberration en haut mais en bas ma bande a 400 PB est si peu concentrée .
Si j ai trop de matériel normalement j aurais du avoir une bande a 400 intense non ?!

[Yoyo]

Non car la fixation de l'intercalant est évidemment proportionnelle à la taille de la molécule. Donc les grands fragments vont fixer plus de BET (ou équivalent) que les petits.
En plus tes petits migrent dans le front de migration (zone noire sur la photo) ce qui diminue encore la fluorescence des bandes.

Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]