Compréhension d'un article sur les OGMs

[invite81985c43]

Bonjour à tous,

Dans le cadre d'un examen en 1ère Master je dois lire un article, le comprendre évidemment et le présenter. D'habitude ça va mais ici j'ai du mal avec le matériel et méthode et cela me bloque pour le reste de la compréhension.

Ce texte (que j'ai joint) parle de l'activité des Jasmonates sur la résistance à des stress biotiques.

Pour moi, pour générer un OGM, on devait ajouter ou utiliser des sites de restrictions déjà présent et cliver ces derniers par une enzyme de restriction (ER) d'une part dans le gène d'intérêt que l'on veut ajouter dans l'OGM et d'autre part dans le plasmide ou vecteur qui transportera ce gène d’intérêt. Ensuite une ligase se chargera de former notre plasmide ou notre vecteur présentant notre gène d’intérêt.

Dans le cas du plasmide Ti d'agrobactérium, de manière similaire on y ajoute notre gène d'intérêt qui va remplacer l'ADN-T, ce plasmide est réintégré au sein d'agrobactérium et ce dernier infecte ensuite une plante et transfert l'ADN-T, on obtient donc comme ça un OGM.

Les problèmes sont :

1) Dans le texte on parle en 2.2 et en 2.4 de deux construction de vecteurs, je ne vois pas à quoi sert le premier "Expression and purification of recombinant Ta-JA1 protein in E.coli" et pourquoi on utilise un vecteur en 2.4 et pas un plasmide Ti...

2) En 2.4 ils parlent de deux méthodes : Freeze-thaw et leaf disc. Le freeze thaw permet simplement de briser les cellules d'Agrobacterium tumefaciens pour que les vecteurs contenant le gène d'intérêt (qui remplaceraient donc le plasmide Ti ?) entrent dans la cellule ?
Et le leaf disc, comme expliqué ici : http://www.life.umd.edu/cbmg/faculty.../leafdisc.html servirait simplement de moyen d'infection par notre A. tumefaciens sur notre plante ?

3) Je ne comprends pas le lien entre les érythrocytes, l'agglutination, l'inhibition et le sucre utilisé. J'ai bien compris que les lectines préféraient se lier au mannose mais je ne comprends vraiment pas ce qu'ils expliquent, le processus par lequel on détermine cette préférence.

Ai-je bien compris la formation d'OGM ?

Un grand merci d'avance .

Bio911
-----

[invite81985c43]

Puis-je faire un copier/coller de la partie de texte concernée ici bien que cet article soit d'accès privé ?

[invitec9f0f895]

Puis-je faire un copier/coller de la partie de texte concernée ici bien que cet article soit d'accès privé ?

Oui si tu copies juste le paragraphe que tu ne comprends pas.

YOyo

[invite81985c43]

Voilà :
"2.2. Expression and purification of recombinant Ta-JA1
protein in E. coli
For the convenient cloning of Ta-JA1 in pET32a vector (Novagen,
USA), EcoRI and HindIII sites were introduced by PCR at the ATG
start codon and TAG stop codon, respectively. PCR was carried out
in a 50 mL volume of Gibco PCR buffer with 1 mmol/L primers,
0.4 mmol/L of each dNTP and 2.5 U Tag DNA polymerase (Gibco)
using forward primer 50-CGGAATTCATGGCCAATTTCCAGATAAC-30 ,
and reverse primer 50-CCCAAGCTTTTAGAGAGGGAGCACGTAGAC-30 .
The fidelity of the PCR amplification was confirmed by DNA
sequencing. The PCR product was digested with EcoRI plus HindIII
and ligated into pET32a vector, and then introduced into E. coli
strain BL21 cells. The bacterial culture was grown at 37 C until
OD600 ¼ 0.7, then moved to 16 C shaken for 1 h. After that IPTGwas
added to the final concentration of 0.5 mM and the culture was
continued to grow at 16 C for 24 h. All purification steps were
carried out at 4 C. Induced E. coli cells were pelleted by centrifugation
at 2000 g for 10 min and re-suspended in extraction buffer
(50mMTris pH8.5, 500mMNaCl,10% glycerol,1% Triton X-100, add
20 mM mercaptoethanol and 1 mM PMSF freshly). After added
freshly made lysozyme to 100 mg/mL, the cells were incubated at
30 C for 15 min. The extracts were sonicated 2 min with 20 cycles
per minute and sonication was repeated 3 times, and then spun at
15,000 g for 15 min. The supernatant was used for further purification
by Ni-NTA His-Bind Spin Columns (QIAGEN, USA) according
to the manufacturer's instructions. Protein concentrations were
determined by the Bradford assay [25] with bovine serum albumin
(BSA) as standard.

2.3. Agglutinating activity and carbohydrate-binding tests
Agglutinating activity was determined using rabbit erythrocytes
[26]. Freshly washed rabbit red blood cells in PSB (150 mM NaCl,
68.4 mM Na2HPO4, 31.6 mM NaH2PO4, pH 7.0) were tested for the
hemagglutination by various proteins. 20 mL protein solution (1 mg/
mL) was serially diluted in two-fold increments and then added to
the different wells with 2% erythrocyte suspension in a 96-well
plate. The mixture was kept for 1 h at room temperature and then
examined visually for agglutination. The carbohydrate-binding
specificity was determined by the inhibition of agglutination of
rabbit erythrocytes with glucose, mannose, galactose and N-acetyl-
D-glucosamine, which were serially diluted from a starting
concentration of 300 mM. Solutions containing 10 mL of the purified
Ta-JA1 and 10 mL saccharides were pre-incubated for 1 h, then 20 mL
2% rabbit erythrocyte suspension was added, and the agglutination
was evaluated after 1 h at room temperature. The lowest concentration
of saccharides that visibly decreased agglutination was
defined as the minimum inhibitory concentration (MIC).

2.4. Plasmid construction and generation of transgenic tobacco
The full-length Ta-JA1 cDNA was amplified by PCR with forward
primer 50-GTCGGATCCACTAGTCACCATGGCCAATT-30 and reverse
primer 50-CGCGAATTCAATACACACCGAAAATGAGAG C-30 . BamHI and
EcoRI sites were introduced by PCR at 50-terminus and 30-terminus
of Ta-JA1, respectively, for the convenience of subcloning. PCR was
carried out with 1 mmol/L primers, 0.4 mmol/L of each dNTP and 2.5
U Taq DNA polymerase (Gibco). The PCR product was digested with
BamHI plus EcoRI and ligated into pBI121 expression vector [27]. The
fidelity of the constructionwas confirmed by enzyme digestion and
DNA sequencing. The resulting binary vector was transferred by the
freeze-thawmethod into Agrobacteriumtumefaciens strain LBA4404.
Tobacco (Nicotiana tabacum cv Wisconsin 38) was transformed
by the leaf disc method as previously described [28]. Rooted transformants
were transferred to soil, grown in the greenhouse and
allowed to self-pollinate.
Total DNA was isolated from young leaf tissues of each tobacco
lines as described by Edwards et al. [29]. PCR was conducted with
forward primer 50-ACTAGTCACCATGGCCAATT-30, and reverse
primer 50-AATACACACCGAAAATGAGAGC-30, which were corresponding
to wheat Ta-JA1 cDNA sequence. The temperature
program for PCR was 5 min at 95 C, followed by 35 cycles of 1 min
at 95 C, 1 min at 56 C, and 1.5 min at 72 C, followed by 10 min at
72 C. The amplified products were resolved on a 0.8% agarose gel
and then photographed."

Merci beaucoup.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

Salut
en 2.2 on décrit un vecteur d'expression qui permettra de surexprimer une protéine pour la purifier par la suite.
Je n'ai pas de réponse à savoir pourquoi ne pas utiliser Ti... une question d'efficacité?

Pour le dernier point visiblement ils font un test de compétition pour voir si les molécules qu'ils utilisent sont capables d'entrer en compétition. Mais avec juste un paragraphe ce n'est pas évident... peut etre que quelqu'un de plus familié avec la technique passera pas ici

YOyo

[invite81985c43]

Merci beaucoup,

En 2.2 j'ai cru comprendre qu'on utilisait E. coli pour une reproduction du gène d'intérêt élevée pour ensuite le purifier, le mystère de l'utilisation d'un autre vecteur que Ti dans le 2.4 n'est par contre pas encore résolu lui, merci de ta réponse en tout cas !

[invitec9f0f895]

De rien, en effet la surproduction d'une protéine à purifier s'effectue fréquemment dans E. coli.

YOyo

[invite81985c43]

Et donc, une fois obtenu notre gène d'intérêt en surproduction et purifié, c'est celui là qu'on est censé reprendre en 2.4 pour la suite de l'analyse, sinon le 2.2 aurait été inutile ? Ensuite on reprend donc la séquence qu'on amplifie de nouveau en PCR pour y introduire de nouveaux sites de restriction et recréer un vecteur qui sera cette fois inséré dans le tabac par la technique leaf disk (si j'ai bien compris) ?