Bonjour à tous,
Dans le cadre de mon stage de Licence, je suis censé, dans un CHU, développer une méthode de CGH sur tissus FFPE (les profils, observés à l’aide du logiciel CytoGénomic, sont ininterprétables). Je dispose donc d’un protocole de base, mais, ayant commencé les manips cette semaine, malgré une extraction ayant conduit à une quantité plus que suffisante d’ADN (déterminée au nanodrop), notre marquage à la cyanine (random priming) à très mal fonctionné sur l’ADN du patient. J’en déduis donc que, malgré une quantité importante d’ADN, celui-ci est surement très dégradé (en cause, le formol) et qu’il faudrait mesurer sa qualité sur Qubit (merci de confirmer).
J’ai donc fait pas mal de biblio et il semblerait (d’après Burcu Sengüven et al. : Comparison of Methods for the Extraction of DNA from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues), que l’étape qui influence le plus la qualité de notre ADN est l’étape d’extraction. Burcu Sengüven ont montré que les plus grandes concentrations d’ADN ont été obtenues lorsque le déparaffinage a été réalisé sur lames et bains de Xylène plutôt que dans des tubes (or, nous l’avons réalisée avec le kit de déparaffinage de QIAamp, dans des tubes) et que plus le traitement à la protéinase K est long, meilleurs sont les résultats (ils obtiennent un bien meilleur ADN après avoir traité à la protéinase K pendant 72h, plutôt que pendant une nuit, or nous n’avons traité que 3h..). Le rôle de la protéine K serait de digérer les cellules et les nucléases (merci de me confirmer ceci..cela voudrait dire que les nucléases conservent leur activité, malgré l’inclusion en paraffine ? Ou seulement une meilleure lyse cellulaire?). Par ailleurs, une incubation à 90°C pendant une heure, après la digestion, permet non seulement d’inactiver la protéinase, mais aussi d’inverser les modifications entrainées sur les acides nucléiques par le formol (notion de cross-linkage avec les protéines, quelqu’un pourrait-il m’expliquer ?).
Je souhaiterais donc, si quelqu’un ici a un peu de temps à me consacrer, que vous le donniez votre avis sr le protocole d’extraction que je propose. Etant limité par les contraintes financières, je ne pourrai pas faire un grand nombre d’expériences..
Je propose ceci :
1 – DEPARAFFINAGE ET LYSE
Sachant que le protocole initial suivait les instructions de QIAGEN, or, je propose de n’utiliser leur kit qu’à partir de l’étape 7 et j’ai augmenté le temps d’incubation avec la protéinase)
1. Placer 4 coupes de tissu FFPE d’une épaisseur maximale de 10 µm dans un microtube de 1,5 mL.
2. Incuber à 56°C pendant 45 min.
3. Déparaffiner sur lame, selon le protocole associé au VP2000.
4. Laver l’échantillon à l’eau distillée.
5. Sécher (sans excès) à température ambiante.
6. Gratter la lame et introduire l’échantillon dans un microtube de 1,5 mL.
7. Ajouter 180 µL de tampon ATL et mélanger en vortexant (l’ATL doit être limpide, sinon, le faire chauffer à 56°C pendant 15 min sur le thermoblock).
8. Centrifuger à 11 000g pendant 1 min.
9. Ajouter 20 µL de protéinase K et mélanger délicatement par pipetage.
10. Incuber à 56°C pendant 24/72 heures et agiter toutes les 3 h au cours de la journée.
11. Incuber à 90°C pendant 1h.
2 – EXTRACTION DE L’ADN
Suivre les instructions du kit QIAamp DNA FFPE Tissue.
3 – QUANTIFICATION DE L’ADN
1. Quantifier la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide du spectrophotomètre Nanodrop (A260 / A280 ≅ 1,80).
2. Mesurer le rendement en ADN à l’aide du fluoromètre Qubit.
Si vous avez des commentaires concernant ces étapes, ou même des conseils pour optimiser le marquage qui suit, ils sont les bienvenus!
Je propose donc de réaliser le protocole de base, ainsi que celui-ci, mais en faisant varier 3 paramètres (j'ai le droit de faire 4 analyses). Tout ceci à partir d'un même échantillon bien sur. Que me conseilleriez vous de faire varier? Le temps d'incubation de la protéinase, afin (dans le cas ou mon protocole fonctionnerait) de déterminer si un temps plus court peut suffir..mais quoi d'autre? Ah, j'ai oublié de dire, j'ai également rajouter les 45 min d'incubation, avant le déparaffinage...
Un grand merci pour ceux qui m'accorderont leur attention!
tic tic
ps : me confirmez vous que le Nanodrop me permet d'identifier la présence de contaminants et la concentration d'ADN, mais pas sa qualité? Raison pour laquelle j'ai besoin du Qubit...en gros, il faudrait peut être que je réalise mon protocole à partir d'une plus grande quantité d'échantillon, afin d'obtenir plus d'ADN de bonne qualité, pour que le marquage en random-priming fonctionne..
Merci encore!
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