Antibiogramme pour tester l'activité de nouvelles molécules.

[efouako]

Bonsoir à tous, j'espère que vous passez une bonne fin de weekend. Je suis entrain d'élaborer un protocole pour tester les activités antibactériennes de molécules que j'ai synthétisées. Mes principales références sont les recommandations de la société française de microbiologie, comité français de l'antibiogramme 2015. Ces recommandations ne proposent pas de protocole pour les concentrations ou les quantités de substance à tester. Elles proposent juste les CMI, la préparation des géloses et des souches. Je me suis donc inspiré de travaux effectués par des tiers pour élaborer un protocole dont je voudrais que vous puissiez me ressortir les insuffisances et me conseiller quoi ajouter, quoi retrancher afin d'avoir quelque chose de potable. En image vous avez le protocole. Merci de me répondre dès que vous le pouvez. Je suis vraiment étouffé par le temps qui me presse. Merci d'avance.
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[noir_ecaille]

Déjà il existe des micropipettes de 100 réglables -- ce qui évite les multi-volumes pour un même prélèvement, donc réduit le delta d'incertitude.

Toujours pour une question de delta d'incertitude, et en l'absence d'une vrai gamme de concentrations, il vaut mieux travailler avec une pipette jaugée ou même graduée de 10 mL pour prélever le DMSO de dissolution.

Rappelons qu'à chaque prélèvement d'un volume (solution mère et solutions filles) c'est un delta d'incertitude de plus par prélèvement. L'idéal est donc de préparer la concentration final en une seule dissolution, et de prélever le volume pour imbiber les disques d'antiobiogramme en une seule fois

Pour une question de mesurr de diamètre et aussi de non confluence d'effet des substances à tester (par diffusion dans la gélose), je conseillerais seulement/maximum 4 disques par boîte de pétri -- donc un total de trois boîtes. On peut d'ailleurs re-répartir les disques à raison de trois pas boîte. Et encore, si je comprends votre protocole, vous utiliseriez deux disques à blanc qui, sans être indispensables, peuvent éventuellement occasionner des contaminations. On peut de fait ne faire que deux boîtes : une de quatre disques et une de trois ; ou même tester une seule fois un disque à blanc pour la même manip, d'où deux boîtes de quatre.


En espérant que ça vous sera utile

[vpharmaco]

Mon plus gros soucis avec ce protocole, tel qu'il est écrit, c'est qu'il te servira principalement à évaluer la toxicité du DMSO sur tes souches bactériennes !
La règle de base est de ne jamais faire évoluer deux paramètres simultanément. Dans ton protocole, chaque disque présente une concentration d'antibiotique et une quantité de DMSO différents. Il te faut déposer sur chaque disque le même volume de solutions, avec des concentrations différentes en antibio.

Deuxième inquiétude: le DMSO. Je n'ai jamais bossé sur des bactéries, mais je suppose qu'elles sont sensibles au DMSO (sur cellules eucaryotes, on dépasse rarement 1% DMSO, voire 0.1% DMSO suivant les lignées). Tu as tout intérêt à préparer une solution stock concentrée dans le DMSO, et ensuite à la diluer autant que possible (et que la solubilité le permet) dans de l'eau ou un tampon pour préparer tes disques.

Un dernier détail: si tes composés n'ont jamais été testés, je commencerais plutôt par une gamme de concentration plus large (par exemple des dilutions au 1/3 ou au 1/10eme) dans l'espoir de mettre en évidence un effet dose, quitte a re-tester les composés par la suite sur une gamme plus rétrécie

[efouako]

Merci à tous. Je vais modifier le protocole et je vous ferai part du nouveau. Merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[efouako]

Bonjour à tous. J'ai refait le protocole. Cette fois-ci le volume déposé est le même et ce qui change c'est la concentration en substances. Ceci est plus conforme aux recommandations. Concernant le DMSO, j'ai des rapports de travaux antérieurs d'équipes de recherche qui prouvent que le DMSO n'a pas d'activité antibactérienne ni antifongique aux volumes de 10, 25 et 50 microlitres déposés sur les disques utilisés. Pour les dilutions successives que je fais, je suis effectivement conscient du décuplement de l'incertitude au fur et à mesure cependant c'est la technique qui me permette le mieux de gérer les quantités de mes substances. J'ai d'autres activités à tester. Pensez-vous que je peux garder le même protocole pour l'activité antifongique? J'ai bien envie de préparer les substances et de conduire ces deux tests d'activités en parallèle. Merci pour vos interventions.

[noir_ecaille]

Ta ta ta !

Ici on est dans la méthode par diffusion, donc il se créer naturellement un gradient de concentration à partir des diques. Pas besoin de faire une gamme, juste utiliser son double-décimètre et trouver un de ces abaques de diffusion en milieu gélosé.

Faire une gamme ne serait pertinent que dans le cas d'une intégration directement dans la gélose -- soit dans la préparation/formule brute, soit lors d'une homogénisation post-autoclave lorsqu'elle est encore en surfusion. C'est une autre possibilité envisageable dans la mesure où, à raison d'une gamme de dillutions (et boîtes de pétri × 3) par substance testée, on a la possibilité de faire une étude de croissances comparées pour une substance donnée en fonction de la concentration/dilution. Ça se fait aussi en milieu non gélosé (tubes).

La gamme (= sans disque) est intéressante si on souhaite éventuellement créer son propre abaque. Cela permet d'évaluer c dite dose minimale critique (pour inhiber les bactéries), voire C dite dose maximale critique (pour tester la toxicité, par exemple avec de la peau artificielle), par approximations succéssives -- nécessité de répéter l'expérience avec de nouvelles gammes autour des concentrations s'approchant des effets recherchés.

[noir_ecaille]

Pour inspiration + explications

http://www.cdc.gov/cholera/pdf/fr/ch...9los%C3%A9.pdf

[efouako]

Pour inspiration + explications

http://www.cdc.gov/cholera/pdf/fr/ch...9los%C3%A9.pdf

Je comprends ce que tu dis mais tu dois reconnaître aussi que si un gradient de concentration s'installe naturellement après dépôt des disques. Le fait de faire une gamme de concentrations serait bénéfique pour mon étude car elle concerne de nouvelles molécules jamais synthétisées ni testées auparavant. Ce que je veux dire par là est ceci: puisque les concentrations diffèrent, plus près du disque, les concentrations seront proches de celles du disque. Plus on s'éloigne du disque, plus la concentration diminue. Ma méthode me permettra non seulement d'étudier la sensibilité aux antibiotiques mais aussi d'avoir une idée sur l'ordre de CMI. Les études faîtes par de précédentes équipes de recherche dont j'ai les rapports sur de nouvelles molécules visaient essentiellement à savoir s'il y a une sensibilité. Ce qui intéressait ces équipes était de pouvoir dire: sensibilité + ou sensibilité -. Ta référence que tu m'as donnée à lire ne mentionne rien qui aille à l'encontre de mon protocole. Comme je l'ai déjà dit plus haut, les recommandations internationales ne précisent comment préparer les nouvelles substances, ni quelles concentrations tester.

J'ai besoin que les autres réagissent aussi afin de peaufiner ce protocole rapidement.

[noir_ecaille]

Avoir un gradient (=gamme de dillutions) de gradients (=diffusion par dépos de dique) ? C'est juste se compliquer les calculs et les manips.

D'ailleurs une CMI se détermine en milieu liquide (= sans disque, mais avec des concentrations dans le milieu uniformes et précisément connues plutôt que pifométriques) avec justement gamme de dillutions précises. On mesure ensuite la turbidité après incubation, pour vérifier s'il y a ou pas la moindre croissance.

C'est en effet différent de l'antibiogramme où les CMI standard sont connues.

[efouako]

Que proposes-tu?

[noir_ecaille]

Préparer une solution mère stérile de "l'antibio" à tester.
Préparer en conditions stériles 500 mL du milieu d'incubation.

Préparer deux tubes stériles de 10 mL à partir du milieu d'incubation pour le témoin positif (= croissance non inhibée) et le témoin négatif (= pas d'ensemencement).

D1 : Dans une première fiole (stérile) de 50 mL, mettre 5 mL de solution mère puis compléter qsp avec le milieu d'incubation. Homogénéiser.
D2 : Prélever 5 mL de D1 à introduire dans une fiole (stérile) de 50 mL puis compléter qsp avec le milieu d'incubation. Homogénéiser."
D3 : (...)
D4 : (...)
D5 : (...)
Préparer un (ou deux voire trois) tube stérile de 10 mL pour chaque dillution.

Note : On peut aussi/ensuite utiliser des gammes de dilutions au facteur 1/4 voire 1/2 si on a déjà bornée une première fois la valeur de CMI.

Préparer l'innoculum avec calibrage de turbidité (McFarland standard).
Ensemencer à l'anse (calibrée si on veut être rigoriste à fond de câle) à partir de l'innoculum, le tube témoin positif, puis les dilutions en commençant par la plus grande.
Ne surtout pas ensemencer le témoin négatif !

Y'a plus qu'à incuber.


La lecture s'effectue sur fond noir (derrière les tubes) par évaluation de la turbidité. On cherche bien sûr le tube de la première dillution ne présentant aucune croissance visible (comparer avec le témoin négatif).
Si aucune des dillutions préparées ne présente de croissance, vérifier le témoin positif. En cas de témoin valide, recomencer la gamme avec une dillution plus forte.


Avec ça, ce devrait se faire tout seul.

[noir_ecaille]

Je reformule, pour écarter une possible erreur de compréhension :

À partir de l'innoculum, effectuer chacun des ensemencements. Par sécurité/praticité, d'abord le tube témoin positif, puis chaque dilution en commençant par la plus grande.

[efouako]

Salut. J'adhère à ta méthode, mais j'ai synthétisé juste la quantité qu'il faut pour tester 4 activités. Ta méthode semble consommer trop en quantité de substances, vu que je dois faire les manipulations 4 fois pour l'analyse statistique. Je voudrais plutôt élaborer un protocole pour tester la sensibilité en microplaques. Je n'ai jamais manipulé en microplaques. Du coup je ne sais pas trop comment cela doit se faire.

[noir_ecaille]

"Microculture" en microplaque ? Hm... Personnellement je ne connais pas, et j'ai du mal à imaginer un protocole fiable allant avec dans le cadre d'une détermination de CMI


Côté microtubes (Eppendorf), le plus petit volume pertinent à utiliser, ce serait des microtubes de 2mL. Sinon on ne verra même pas la turbidité. Et encore, on peut craindre quand même une inhibition de croissance par défaut de ressources (et concentrer le milieu peut aussi le rendre négativement sélectif). L'ensemencement à l'anse calibrée est un passage ici obligé. À boucher au coton pour un volume de milieu au minimum de 1,5mL (d'où microtubes de 2 mL).

J'ai pensé à l'éventualité d'une lecture par Ig adsorbés sur microbilles, mais ça donnerait des faux positifs -- en principe on ne cherche pas la présence de l'innoculat mais une croissance à partir de l'innoculat de départ, hors les Ig ne feront pas la distinction.

Même constat à propos de réactifs concernant le métabolisme de l'innoculat.

Ça reste du bidouillage... À essayer mais si ça ne donne rien de lisible/fiable, ou si on veut éviter les doutes de lecture (plus facile de lire une turbidité légère dans un tube en verre que dans un microtube de plastique), repasser impérativement à un protocole en tubes à essais.


Le mieux serait quand même de resynthétiser un milieu de croissance liquide et en suffisance (= n × 500 mL) pour CHAQUE substance à tester. En gros séparer l'étude des substances et faire n protocoles identiques au détail près de la substance testée. Avec n, le nombre de substances dont on souhaite déterminer la CMI.

[noir_ecaille]

PS : De toute façon il faudra affiner la CMI, id est refaire plusieurs fois la manip pour une même substance -- avec des concentrations s'étalonnant entre la précédente première dilution ne présentant pas de croissance et la dilution qui la suit d'un facteur.

On n'échappera donc pas à la resynthèse de milieu de croissance.

[noir_ecaille]

Lu trop vite hier soir, et manqué ça :

je dois faire les manipulations 4 fois pour l'analyse statistique.

Pas forcément. On peut, comme évoqué en #11, préparer plusieurs tubes par dillution (1, 2, 3, 4 tubes...) du moment qu'on s'assure de synthétiser du milieu de croissance en suffisance.

Seule l'affinage de la CMI nécessite après coup une resynthèse de milieu et repréparation des nouvelles dilutions.

Puis c'est quand même plus propre que tenter une microculture sur microplaque avec incubation minimum une nuit à 48h, où les puits sont ouverts à tooouuus les contaminants possibles et imaginables. Les micropuits ne servent pas pour des longues durées, seulement des manips immédiates avec lecture dans la foulée ou peu s'en faut.

Quant à utiliser une gamme bidouillée en Eppendorfs, une incertitude d'une goutte a moins d'incidence sur du 10 mL que sur du 1 mL -- et on revient encore au problème d'incubation qui ne peut pas être hermétique (échanges gazeux oblige pour une croissance optimale) mais mettre du coton, j'avoue que ça me fait quand même grimacer vu la taille des trucs :-/ En fait ce serait beaucoup mieux de bidouiller ça plutôt en tubes à hémolyse (5 mL) en verre, si possible du 2,5 mL peut-être à peine incliné pendant l'incubation.