[Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en qPCR

[invitec56b671a]

Bonjour à tous,

Je fais appel à vous pour optimiser ma technique en qPCR. J'ai un peu de mal à obtenir des duplicates avec moins de 0,5 Ct d'écart (quelques un sur ma plaque, pas tous les duplicates non plus).
Je vais vous présenter ma méthodologie et matériel et n'hésitez pas à me faire vos remarques pour m'aider à m'améliorer !

Pour déposer mon mix (SYBR Green) j'utilise une pipette de 20 µl. Je dépose 8 µl par puits (plaque 96). Je prémouille d'abord mon cône puis je dépose avec le même cône tout mon mix.
Pour cette étape, que puis je améliorer? Changer plus souvent de cône? Utiliser une multipette?

Ensuite, pour déposer mes cDNA (2µl par puits), j'utilise une pipette de 10µl. Je change de cône à chaque puits. Cette fois, pas de prémouillage, j'aspire le volume et dépose dans mon puits. Je dépose ma goutte directement sur la paroi. Je centrifuge ensuite ma plaque avant de lancer mon run.

Je vous remercie pour toutes les critiques que vous pourrez m'apporter pour m'aider à m'améliorer !
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[invitec56b671a]

Bonjour,

Je me permets de relancer ma demande à l'aide.


Merci à tous

[invitec56b671a]

[Flyingbike]

je peux que vous suggérer de bien homogénéiser votre mix et vos exhantillons a chaque vois (vortex puis centri), en dehors de cela, sans voir je sais pas trop quoi vous dire. Les variabilité de volume de mix ne sont pas les plus graves puisqu'il y a une référence fluo interne et par expérience ce n'est pas cela qui est le plus problématique. vous avez une multicanaux ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec56b671a]

Merci pour ton retour flyingbike.

J'homogénéise bien les mix (vortex puis centri). Nous n'avons pas de multicanaux, je dépose à la pipette classique puits par puits avec le même cône.
Si je devais remettre en cause une étape, je dirai que déposer 2µl de cDNA avec une pipette de 10µl n'est pas optimal, pensez-vous que mes variations puissent venir de là?

Merci encore

[invitec56b671a]

[Flyingbike]

proprement pipette, 2µL avec une 10 cela doit pouvoir se faire, l'idéal étant d'avoir une P2 bien entendu....

c'est quoi votre machine/réactif ?

[invitec56b671a]

Réactif : SYBR Green
Appareil : Light Cycler 96 (et anciennement LC480)

[Flyingbike]

cous centrifugez bien la plaque après quand même ?

[invitec56b671a]

Oui bien sûr, la plaque est systématiquement centrifigée