organisation plasmide

[ludo7878]

bonjour,

Je viens de débuter en biologie moléculaire, je me pose des questions sur les plasmides.

Dans un plasmide expression( rapporteur) : il y a un gene de résistance pour le sélectionner, une origine de réplication, un MCS et par exemple le gène lacZ juste apres.

Je voulais savoir si dans le MCS, on inséré plutot un gene avec son promoteur, son promoteur seul ou le gene seul sans promoteur.

parce que moi je vois plus dans le MCS promoteur+gene

car apres cela depend comment le plasmide est construit, si avant le mcs il y a un promoteur on y insere que le gene commençant par ATG(codon start)

Cela peut paraitre une question idiote

Merci de la reponse.
-----

[ludo7878]

petit up
merci

[ludo7878]

Je fais remonter le post, car je n'ai pas obtenu de reponse

[Loupsio]

dans le cas de LacZ pour la complementation ce n'est pas le gène entier, juste une sous unité, et il se trouve derrière un promoteur constitutif qui n'est pas le promoteur initial de l'opéron lactose si je ne m'abuse

[A voir en vidéo sur Futura]

[Aqualung]

bonjour,

Je viens de débuter en biologie moléculaire, je me pose des questions sur les plasmides.

Dans un plasmide expression( rapporteur) : il y a un gene de résistance pour le sélectionner, une origine de réplication, un MCS et par exemple le gène lacZ juste apres.

Je voulais savoir si dans le MCS, on inséré plutot un gene avec son promoteur, son promoteur seul ou le gene seul sans promoteur.

parce que moi je vois plus dans le MCS promoteur+gene

car apres cela depend comment le plasmide est construit, si avant le mcs il y a un promoteur on y insere que le gene commençant par ATG(codon start)

Cela peut paraitre une question idiote

Merci de la reponse.

En fait tout dépend de ce que tu cherches à faire et du type de plasmide utilisé. De ce que j'ai pu voir, la plupart du temps on utilise un plasmide contenant un promoteur d'intérêt et on place dans le MCS le gène d'intérêt.

Il peut arriver que tu doive sélectionner le promoteur pour une construction particulière, dans ce cas là c'est faisable mais plus compliqué car les séquences promotrices sont très variables, souvent situées à une distance pouvant aller jusqu'à 4000 pb pour les plus complexes.

En gros, si tu possèdes le promoteur voulu sur une plasmide du commerce, tu y places seulement le gène et sinon, il s'agit d'une étude beaucoup plus compliquée qu'il me serait difficile de résumer ici.

[Flyingbike]

Non il ne faut pas aller chercher trop loin. Si c'est un plasmide RAPPORTEUR, on veut mesurer l'ACTIVITE d'un PROMOTEUR en mesurant indirectement l'expression d'un gène quantifiable comme ß-galactosidase. Dans ce cas la, on a besoin DU PROMOTEUR d'intérêt et c'est lui que l'on clone dans le MCS en AMONT du gène rapporteur.

[Loupsio]

on veut mesurer l'ACTIVITE d'un PROMOTEUR en mesurant indirectement l'expression d'un gène quantifiable comme ß-galactosidase

Euh personnellement j'ai pas souvenir qu'on se serve de l'alpha complementtion pour mesurer l'activité d'uin promoteur au Xgal, tu ne confondrais pas plutot avec GUS? qui donne une coloration bleue aussi et dont (pour le coup) on place derrière notre promotteur d'intérêt

Put etre que l'alpha complémentation peut aussi etre utilisée en remplacement de GUS, mais la plupart du temps c'est utilisé pour vérifier que notre gène d'intérêt (ou fragment d'intérêt) est bien intégré dans le plasmide,
Si a l'ajout du Xgluc, la colonie est bleue, il n'y est pas, si elle est blanche, il y est

D'autant plus que je vois pas comment tu peux mesurer l'activité de ton promoteur, si quand la transformation est réussi, cela brise le fragment plasmidique de la beta gal et que donc on a plus d'activité beta gal, donc plus de coloration, donc plus rien a doser

[Flyingbike]

si, bien sur, cela se fait, simplement ce n'est pas de l'alpha complémentation mais simplement de l'activité beta-galactosidase, ou on quantifie l'expression de la beta-galacosidase a partir de son activité catalytique. Maintenant on utilise plus la luciférase mais cela se fait encore. Meme in situ si besoin... En tout cas sans plus de contexte du pasteur, on ne peut pas vraiment aller plus loin