HPLC sur des protéines déjà dénaturées

[invitee4e79868]

Bonjour à tous

Je viens vers vous pour vous demander si vous avez des astuces concernant l'HPLC.

Je m'explique. J'ai marqué ma protéine avec une sonde fluorescente. Dans le processus, la protéine est dénaturée (c'est voulu). Je souhaite ensuite savoir combien (en pourcentage) de protéines j'ai marqué.
J'ai déjà réalisé un test de densité (fixation de toute les protéines à une densité connue, puis on compte les protéines fluorescentes).

Mais il faut que je confirme ce résultat par une méthode différente et indépendante. D'où l'HPLC.
Le problème, c'est que ma protéine est déjà dénaturée (avec du SDS entre autre, que j'enlève avec une purification). Et quand j'injecte ma protéine, je n'ai pas de pic, ni dans l'UV, ni en fluorescence dans le gradient, mais juste un tout petit juste après l'injection. Je ne sais pas si elle est coincée dans la colonne ou directement éluée...

Est ce que vous avez des astuces/indices?
J'ai déjà chercher sur le net, mais je n'ai rien trouvé de relevant pour le moment. Mais je continue!

Merci d'avance!
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[vpharmaco]

Bonjour,

Qu'utilises-tu comme colonne pour faire la séparation ?
On analyse régulièrement des petites protéines marquées sur une colonne ProSwift RP-10R sur un systeme LCMS. La colonne est maintenue à 80C. http://www.dionex.com/en-us/products.../lp-73380.html
On sépare ainsi facilement l'excès de sonde fluorescente, de la protéine marquée mais, par contre, la séparation protéine native/protéine marquée x fois est mauvaise. On détermine approximativement le taux de greffage par analyse du spectre MS déconvolué.

Si ta sonde fluo est bien connue, si tu parviens à éliminer l'excès de sonde de la protéine marquée, et si son absorbance est peu impactée par le greffage (çà fait beaucoup de si !), tu peux determiner approximativement le taux de greffage moyen par spectro UV/vis également https://tools.lifetechnologies.com/c...-FP-ratios.pdf

[invitee4e79868]

Merci de votre réponse!

J'utilise une colonne Sepax (SAX-NP5; pour Strong Anion Exchange, non porous particle of 5 micro). Ce type de colonne est également disponible chez ProSwift, et elles permettent de très bonnes résolutions. On n'a que deux colonnes au labo, et l'autre est hydrophobique, donc je ne peux pas l'utiliser.

La sonde est très connue, car c'est Alexa Fluor 488, et l'excès de sonde est normalement éliminé lorsque je purifie pour enlever le SDS est autres réactifs chimiques pour le marquage de la protéine. Par contre, l'absorbance de la protéine devrait être impactée, mais cela doit être mesurable/calculable. Je devrai donc pouvoir utiliser la formule pour déter,iner le taux de greffage moyen.

Après, j'ai questions stupides.
Le SDS est lié à la protéine par des liaisons faibles. On devrait donc pouvoir l'enlever facilement par des lavages/purification, non?
Quelle serait l'effet d'une protéine qui aura encore du SDS sur elle dans la colonne?


Merci de votre temps!

[vpharmaco]

Je n'utilise pas de SDS car on fait de la MS derrière et cela peut être galère, mais je me méfierais tout de même. L'interaction protéine/SDS est tout de même assez forte. Je ne suis pas sûr que tu l'élimines totalement par simple lavage/dialyse. Il me semble que la méthode standard pour éliminer le SDS est de faire précipiter la protéine dans l'acetone.
S'il reste un peu de SDS, n'y a-t-il pas un risque pour qu'il sature ta colonne echangeuse d'anions (je n'ai jamais fait ce type de chromatographie)?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee4e79868]

Oui, c'est excactement ce que je pense.
Bon, je vais passer par l'étape de précipitation à l'acétone alors.

Merci pour les conseils, je vous tiens au courant. Je vais tester cette précipitation demain sur des échantillons frais.

[vpharmaco]

OK. Pour info, le detail du calcul du taux de marquage pour l'Alexa 488 par UV-Vis est précisé ici https://tools.lifetechnologies.com/c...ls/mp30006.pdf