PCR sur pseudomonas aeruginosa

[invite504384bc]

Bonjour tout le monde!!
J'ai un soucis pour effectuer des PCR sur pseudomonas aeruginosa: les PCR marchent une fois sur deux bien que j'utilise de la bétaine. On a déjà essayé de changer plein de choses par rapport à la procédure habituelle: (prendre des composants "tout neuf"), augmenter la quantité d'ADN jusqu'à 35ng (!), extraire l'ADN avec phénol et chloroforme, extraire l'ADN en rajoutant une étape avec du CTAB tout en ayant déjà testé certains kit d'extraction commo le DNeasy tissue kit de QIAGEN...Le problème touche uniquement Pseudomonas aeruginosa dont l'ADN semble se détériorer avec le temps mais on ne parvient pas à trouver un meilleur protocole d'extraction d'ADN; à moins que cette bactérie nécessite des conditions particulières en PCR...
Quelqu'un a-t-il rencontré le même problème? Pouvez-vous m'aider?
Merci d'avance et bonne journée
-----

[invitec4829296]

Question bête : tu as vérifié la séquence de tes oligos ?

ça m'est arrivé d'en commander un dans le sens 3'-5' au lieu de 5'-3' . Alors, forcement avec 2 oligos dans le même sens, ça ne marche pas.

Le labo qui t'a fabriqué les oligos peut s'être trompé dans la séquence. Ca m'est aussi arrivé.

Autre piste : le fragment que tu veux amplifier est trop grand. Par exemple, si les oligos correspondent à une autre espèce bactérienne et qu'il y a une insertion juste entre les 2 oligos chez P. aeruginosa.

Je ne suis pas du tout spécialiste de l'extraction d'ADN bactérien mais ça m'étonne qu'une espèce particulière pose problème.

Annaïck.

[invite504384bc]

J'ai déjà vérifié mes oligos, d'autant que j'utilise au total une quizaine de marqueurs; donc il serait très peu probable que le labo se soit trompé trentre fois.
De plus, mes PCR marchent de temps en temps et j'utilise une taq que l'on fait et que l'on traite nous-même à la DNase pour éviter d'avoir de l'ADN de E.coli, bactérie proche de Pseudomonas pour ces marqueurs. Le soucis, c'est que mes ADN sont très bien amplifiés juste après l'extraction mais, qu'un ou deux mois après, les réactions PCR sont plus faibles voire inexistantes, comme si l'ADN s'était déterioré, alors qu'on le conserve à -20°C. D'où mon désarroi
Bref, c'est le bordel!!!
Merci quand même; c'est sympa
Bonne journée

[invitec4829296]

Si je comprends bien, quand tu fais ta PCR juste après l'extraction ça marche et 2 mois après dans le congélo, ça ne marche plus.

Hypothèse 1: l'ADN est dégradé dans le tube à cause de congélations/décongélations fréquentes
Solution : aliquoter ta prep' en fractions de 20 -50 microlitres dans des épendorff garantis sans DNAse.
et décongeler un tube à chaque fois que tu en as besoin. Le conserver au frigo après décongélation.

Hypothèse 2: il reste de la DNAse dans la Taq "maison" et l'ADN est plus sensible après 2 mois dans le congélo
Solution : faire en paralèlle la PCR avec une Taq du commerce et avec ta Taq sur le même échantillon pour en avoi le coeur net.

Bon courage, c'est toujours dur les truc incroyables comme ça !

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite504384bc]

Tu vas me trouver chiante, mais j'ai déjà essayé tout ça:
- je travaille à partir d'une plaque-mère d'ADN dans laquelle je ne distribue que 100microlitres de dilutions d'ADN: je ne sort donc à chaque fois que cette plaque et mes dilutions et ADN purifiés restent sagement à -20°C et n'en sortent que très rarement (à moins qu'ils s'organisent des petites soirées quand je ne suis pas là!! lol)
- j'ai testé d'autres taq du commerce: celle vendu par Roche, et celle de Fermentas, sans amélioration après comparaison avec ma taq.
Je suis donc complètement bloquée sur cette apparente détérioration d'ADN, ayant déjà testé tout ce qui me venait à l'esprit.
A part génotyper mes bactéries au plus vite après l'extraction, je ne vois vraiment aucune solution
bonne fin de journée et merci quand même pour tout, je me sent moins seule même si je crois que je vais arrêter d'essayer de comprendre ce qu'il se passe!

[piwi]

As tu essayé de piquer ta colonie (ou ton culot, je ne sais pas sous quelle forme tu cultives) et de mettre cela directement en PCR avec un hotstart de 10-15 mins?
Ca fait exploser les bactéries et la PCR se fait sur le lysat sans extraction.
Ca marche pour remplacer les minis prep durant les clonages, m'enfin c'est pas optimal. Mais vu que tu es dans une impasse ca vaudrait le coup de le tenter et d'optimiser si tu sens apres tes tests que ca peut t'aider.

Cordialement,
piwi

[invite504384bc]

Effectivement, je n'ai pas essayé ça. Je vais voir ce que ça donne, car de toute façon ça ne peut pas être pire!!!
Merci beaucoup!!

[invitea1155996]

bonjour,

J'ai exactement le même problème que toi même sur le même témoin dans les mêmes conditions la PCR marche une fois sur deux. Je soupconne un problème de manipulation ou de Taq. As-tu trouvé d'ou vient le problème?

Merci

mélanie

[piwi]

6 ans ont passé depuis son dernier message... Je doute que la question lui importe encore beaucoup, qu'il se souvienne de la réponse, et qu'il passe pour vous répondre. Désolé.

piwi