Séquençage de l'ADN

[Meiosis]

Bonsoir,

Je me posais une question.
Quand on regarde la méthode Sanger on s'aperçoit qu'après dénaturation de l'ADN à séquencer les deux brins se séparent.
Et quand un ddNTP s'incorpore dans le cDNA alors cela renseigne sur le brin matrice à séquencer. Il y a 4 puits avec dans chaque puits un ddNTP précis. Mais ce que je ne comprends pas c'est est-ce que les deux brins de l'ADN à séquencer sont dans le puits ou juste un seul des deux ?

Car séquencer les deux brins est inutile : forcément si on a la séquence d'un alors on a l'autre par complémentarité des bases. De plus avoir les deux brins dans un puits peut poser problème. En effet imaginons un puits avec des ddATP. Si un ddATP s'incorpore dans le cDNA on ne saura pas si c'est une thymine du brin 5' 3' ou une thymine du brin 3' 5'. J'imagine alors que pour la méthode de séquençage on séquence un seul des deux brins et toujours le même dans tous les puits ?

Si c'est bien cela comment virer le deuxième brin qui ne nous intéresse pas ?

Merci.
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[Flyingbike]

pour ce squencage on utilise des primers : on peut donc séquencer spécifiquement un fragment parmi une grande variété d'ADN. La plupart du séquençage se fait sur double brin...

Je rajouterai que maintenant, le séquençage se fait dans un seul tube, puisqu'on utilise des ddNTP fluorescents, plus besoin de faire des réactions séparées.

[Meiosis]

pour ce squencage on utilise des primers

Ah oui les amorces.
Mais comment faire pour la première amorce ? Je veux dire au départ on a un ADN à séquencer inconnu, on synthétise l'amorce au hasard ? Par exemple si on fait une amorce GATCG qu'est-ce qui nous assure que la séquence complémentaire existe au moins une fois sur l'un des deux brins à séquencer, vu qu'on ne connaît pas encore la séquence justement ?

Et même si ça existe, qu'est-ce qui nous assure que la séquence complémentaire de cette amorce n'existe que sur un seul des deux brins ? Car si elle se situe sur les deux (une ou plusieurs fois) on va séquencer les deux brins sans savoir lequel des deux on séquence.

Je demande pour la première amorce car pour les suivants ça ne pose plus problème, si on connaît déjà un début de séquence il suffirait de faire une grande amorce complémentaire afin d'avoir une spécificité très grande et cibler un seul des deux brins.

Mais je crois que je dis n'importe quoi. Je dis ce que je pense. ^^

[Flyingbike]

Ah, si on ne connait rien de la séquence, c'est différent. On peut par exemple la cloner dans un vecteur connu et l'utiliser comme matrice de séquençage, mais on peut aussi utiliser des amorces aléatoires. Qu'il y ait un overlap n'est pas un problème si on a suffisamment de lecture : Renseigne toi sur le "shotgun sequencing" !

[A voir en vidéo sur Futura]

[Meiosis]

Ah je crois que j'ai compris ce que tu veux dire : en gros on accroche la séquence inconnue sur une autre connue (plasmide par exemple) et du coup on peut synthétiser la 1ère amorce complémentaire du plasmide et comme ça le séquençage va se poursuivre dans notre séquence inconnue ?

En schéma simplifié ça donnerait :

[Plasmide de 20 nucléotides par exemple] - [Séquence inconnue]
[Amorce de 20 nucléotides complémentaire au plasmide] - séquençage

Mais je retombe sur le même problème, vu que l'amorce serait spécifique du plasmide on séquencerait les deux brins non ?

Après je passe sans doute pour un noob mais overlap, run etc. je ne sais pas encore ce que ça veut dire. ^^

[Flyingbike]

ouais, t'as compris.

Par contre tu bloques sur le double brin, pour l'explication je vais considérer que tu maitrises la PCR

Contrairement a la PCR classique, qui utilise un couple d'amorces (qui du coup borne la zone amplifiée), on n'utilise qu'une seule amorce en séquençage. Du coup, à chaque cycle, l'amplification démarre depuis cette amorce et sur un seul des deux brins, il peut y avoir n'importe quel autre ADN qui traine, il ne sera pas amplifié tant qu'il ne comporte pas la séquence de l'amorce.

Pour l'overlap, un vieux réflexe d'utiliser des mots anglais mais c'est tellement plus simple qu'en français : il s'agit d'un chevauchement. Imagine qu'on découpe un bouquin en morceaux aléatoires de quelques mots ou en phrases : impossible de le remettre dans l'ordre. Par contre si tu découpes mille bouquins en morceaux aléatoires, tu pourras reconstituer l'histoire puisque les coupures n'auront pas lieu au même endroit sur les mille bouquins.

[Meiosis]

Mais justement vu que l'amorce est complémentaire du plasmide on va séquencer les deux car on aura un truc de ce genre :

[Plasmide de 20 nucléotides par exemple] - [Séquence inconnue brin 1]
[Plasmide de 20 nucléotides par exemple] - [Séquence inconnue brin 2]
[Amorce de 20 nucléotides complémentaire au plasmide] - séquençage brin 1 OU 2

Je veux dire l'amorce est commune aux deux brins et il n'y a rien de spécifique vu que ce qu'on cible c'est le plasmide et pas la séquence inconnue.

Après je connais la PCR mais uniquement le principe (càd à quoi ça sert), j'avais survolé ce sujet mais je vais devoir le revoir également. Je bloque sur plusieurs techniques là, je dois également voir le pyroséquençage etc. bref c'est la fête.
Il faut que j'étudie plus en profondeur ce qu'il se passe au niveau des brins à chaque fois et c'est ça qui me pose problème, je ne sais pas pourquoi, je maîtrise pourtant la réplication/transcription etc. dans le milieu naturel. Et ces techniques ne font qu'exploiter ça.

[Flyingbike]

Mais justement vu que l'amorce est complémentaire du plasmide on va séquencer les deux car on aura un truc de ce genre :

[Plasmide de 20 nucléotides par exemple] - [Séquence inconnue brin 1]
[Plasmide de 20 nucléotides par exemple] - [Séquence inconnue brin 2]
[Amorce de 20 nucléotides complémentaire au plasmide] - séquençage brin 1 OU 2

Je veux dire l'amorce est commune aux deux brins et il n'y a rien de spécifique vu que ce qu'on cible c'est le plasmide et pas la séquence inconnue.

Après je connais la PCR mais uniquement le principe (càd à quoi ça sert), j'avais survolé ce sujet mais je vais devoir le revoir également. Je bloque sur plusieurs techniques là, je dois également voir le pyroséquençage etc. bref c'est la fête.
Il faut que j'étudie plus en profondeur ce qu'il se passe au niveau des brins à chaque fois et c'est ça qui me pose problème, je ne sais pas pourquoi, je maîtrise pourtant la réplication/transcription etc. dans le milieu naturel. Et ces techniques ne font qu'exploiter ça.

je ne comprends pas le problème.... Sur les deux brins complémentaires, l'amorce ne s'hybride que sur un seul !

[Meiosis]

Sur les deux brins complémentaires du plasmide ?

S'il s'agit bien du plasmide oui elle s'hybride sur un seul des deux mais ensuite ce brin de plasmide (un des deux) peut fixer les deux brins à séquencer et du coup on séquencera des fois l'un des fois l'autre, c'est ce que je veux dire. Et sans savoir lequel on séquence.

[Flyingbike]

hhhm ok, j'avais pas compris ton souci...

Il y a plusieurs cas de figure, ça peut devenir compliqué. Déjà cela dépend de ce qu'on cherche, si on cherche un gène ou un CDS, c'est facile de le trouver à partir de la séquence, lequel des brins est codant. Ensuite, cela dépend aussi d'ou vient le fragment. S'il est obtenu par PCR, ou par digestion enzymatique (sauf blunt) par exemple, on sait dans quel sens il sera inséré dans le plasmide. Si on fait du séquençage total (comme WGS par ex), on s'en fout un peu puisqu'il y aura, après reconstitution, des séquences codantes sur les deux brins...

On pourrait continuer longtemps dans les généralités, mais je te laisse revenir avec des questions en fonction du cas de figure que tu considères.

[Meiosis]

Je n'ai pas forcément de contexte mais pour mieux comprendre disons la PCR.
J'ai revu la PCR comment ça fonctionne, je pense l'avoir compris (même s'il reste des points obscurs comme comment s'arrête la polymérase dans la réaction, bref).

Donc dans la PCR on amplifie les deux brins mais une petite partie du génome à amplifier, j'imagine donc que ce n'est pas une technique adaptée à la génomique car ensuite on ne peut séquencer que la petite partie amplifiée par PCR ?

J'imagine en effet qu'on ne fait pas de PCR sur un génome entier.

Donc on a les deux brins amplifiés, tu dis :

S'il est obtenu par PCR, ou par digestion enzymatique (sauf blunt) par exemple, on sait dans quel sens il sera inséré dans le plasmide.

Je ne vois pas comment on saura si c'est le brin 3' 5' qui sera inséré en face de tel brin du plasmide ou l'autre brin.

Par ailleurs tu précises qu'on s'en fout avec le séquençage total, mais pour moi ça pose un véritable problème de ne pas savoir lequel des deux brins on séquence.
Peut-être que je m'explique mal depuis le début mais disons qu'on arrive à un ddATP, on dira alors qu'il y avait une thymine sur le brin à séquencer.

Si plus tard on a un autre fragment arrêté 4 nucléotides plus loin, toujours avec un ddATP, on pourra penser qu'il y a une thymine à 4 nucléotides plus loin sur le même brin alors que peut-être c'est une thymine 4 nucléotides plus loin sur le brin complémentaire de celui à séquencer, et que du coup c'était une adénine 4 nucléotides plus loin sur le brin à séquencer.

On pensera alors TxxxT au lieu de TxxxA.

[Meiosis]

Pour éviter de refaire un sujet je UP ici.

Concernant le pyroséquençage je l'ai compris mais j'ai une question : on utilise l'apyrase pour dégrader le surplus du nucléotide en excès qu'on vient de mettre dans le milieu (par exemple cytosine) mais aussi le surplus d'ATP afin de ne pas fausser les résultats.

Je ne vois pas pourquoi il y aurait surplus d'ATP puisque de toute façon tout l'ATP est utilisé par la luciférase, non ? Par exemple si 2 cytosine s'insèrent de suite alors ça fait 2 PPi et donc 2 ATP utilisés par la luciférase, il en reste 0. Et s'il n'y a pas réaction avec le nucléotide alors pas de production de PPi et donc pas d'ATP produit par la sulfurylase.